雌性牦牛主要生殖器官中DBI的表达与定位分析

为加深对DBI基因功能的探究,揭示其在牦牛生殖生理过程中的作用。本试验采集健康母牦牛（3～6岁）繁殖周期不同阶段（卵泡期、黄体期和妊娠期）的卵巢、输卵管和子宫组织,共分为9组,每组设置3个生物学重复。采用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）和蛋白免疫印迹技术（Western blotting,WB）检测牦牛DBI在繁殖周期不同阶段雌性牦牛生殖器官中的相对表达量;通过免疫组织化学方法（immunohistochemistry,IHC）定位DBI蛋白在雌性牦牛卵巢、输卵管和子宫中的分布情况。结果表明：1） qRT-PCR结果显示,在卵巢中,DBI在黄体期和妊娠期的表达量显著高于卵泡期（P<0.05）;在输卵管中,DBI在黄体期表达量显著高于卵泡期和妊娠期（P<0.05）;在子宫中,DBI在妊娠期表达量最高,黄体期次之,卵泡期最低。2） Western blotting结果表明,在卵巢中,DBI在妊娠期的水平显著高于卵泡期和黄体期（P<0.05）;在输卵管中,DBI在黄体期水平显著高于卵泡期和妊娠期（P<0.05）;在子宫中,DBI在妊娠期水平明显高于黄体期和卵泡期（P<0.05）。3） IHC结果显示,DBI主要位于生殖上皮细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞、黄体细胞、输卵管上皮细胞、子宫基质细胞和子宫腺中。DBI在牦牛繁殖周期不同阶段的卵巢、输卵管和子宫组织中的表达量存在显著差异,说明其参与牦牛生殖生理调控,为进一步挖掘DBI基因在高原哺乳动物生殖方面的研究奠定相应的理论基础。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

OPN5对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响

旨在研究视神经蛋白（neuropsin,OPN5）对鸭颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素生成的影响。本研究分别对鸭颗粒细胞进行OPN5过表达质粒和OPN5 siRNA处理72 h （n=6）,应用EdU细胞增殖检测技术、流式细胞技术、Annexin V-FITC、RT-PCR、Western blot及ELISA技术系统地检测颗粒细胞的增殖、凋亡情况及生殖相关基因的mRNA、蛋白水平及激素水平的变化规律。结果显示,OPN5过表达能促进鸭卵泡颗粒细胞增殖,抑制鸭卵泡颗粒细胞凋亡;能极显著地促进GnRHR、FSHR、LHR的表达 ,并抑制GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;能显著或极显著上调StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1、CYP19A1的mRNA水平（P<0.05或P<0.01）;显著升高OPN5、3β-HSD及CYP19A1的蛋白表达水平（P<0.05）和极显著升高E2、P4分泌水平（P<0.01）,并极显著降低INHβ的水平（P<0.01）。OPN5 siRNA能够显著降低OPN5的表达水平（P<0.01）,抑制卵泡颗粒细胞增殖并促进凋亡,极显著下调GnRH、GnRHR、FSHR、LHR（P<0.01）,促进GnIH、GnIHR的表达（P<0.01）;并极显著抑制StAR、CYP11A1、CYP17A1的表达（P<0.01）;显著降低OPN5、3β-HSD及CYP19A1蛋白表达水平（P<0.05）及极显著降低E2、P4的分泌水平（P<0.01）,并能极显著升高INHβ的水平（P<0.01）。研究表明,OPN5能促进鸭卵泡颗粒细胞的增殖,抑制其凋亡,促进颗粒细胞中类固醇激素的生成和分泌。     

整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位

旨在探究整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达差异,为进一步了解整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛（3~6岁）的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品,将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western-blotting,WB）检测整合素αv基因和蛋白的表达情况,运用免疫组织化学法检测整合素αv的定位。结果表明：1）qRT-PCR结果显示,在卵泡期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv基因在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）。2）Western-blotting结果显示,在卵泡期,整合素αv蛋白在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv蛋白在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv蛋白在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著,但二者极显著高于壶腹部（P<0.01）。3）免疫组织化学结果显示,整合素αv主要分布于输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中。结果显示,整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达存在显著差异,说明其可能参与了牦牛受精及早期胚胎发育等一系列生殖过程,为牦牛的繁殖性能研究提供了基础资料。     

CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制及功能分析

旨在分析组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）对黔北麻羊卵泡颗粒细胞的调控机制并初步探究其对产羔性状的影响机理。本研究以36周龄、健康、多胎黔北麻羊母羊（n=5）为研究对象,屠宰后采集卵巢组织分离培养卵泡颗粒细胞,构建真核表达载体pEGFP-N3-CTSD,将其导入细胞后在转录与翻译水平验证真核表达效率;通过CCK-8法检测在不同时间段内重组质粒对颗粒细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测重组质粒对颗粒细胞凋亡及周期的影响;随后使用RT-qPCR法在细胞水平检测重组质粒对细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3,细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E mRNA表达水平的影响,最后,以多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为功能基因,在转录与翻译水平上验证重组质粒对其mRNA与蛋白表达的影响。双酶切及测序结果证实,黔北麻羊CTSD基因真核表达载体pEGFP-N3-CTSD构建成功,且在转录与翻译水平极显著上调CTSD在颗粒细胞中的表达（P<0.01）;细胞增殖检测结果表明,颗粒细胞中上调CTSD后能够抑制细胞的增殖,其中在12、24、48、72 h对细胞增殖的抑制效率达到极显著（P<0.01）;细胞凋亡检测结果表明,CTSD的过表达能够极显著促进颗粒细胞的凋亡（P<0.01）,且能够显著下调细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达（P<0.05）,极显著上调细胞促凋亡相关基因Bax、Caspase-3的表达（P<0.01）;此外,细胞周期检测发现,pEGFP-N3-CTSD在转染后能够极显著上调G0/G1期与G2/M期的细胞数量（P<0.01）,极显著下调S期细胞数量（P<0.01）,同时能够极显著提高细胞周期相关因子Cyclin A1的表达（P<0.01）,极显著降低Cyclin D2的表达（P<0.01）。RT-qPCR及Western blot检测结果表明,在颗粒细胞中上调CTSD后,能够极显著的下调多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA在转录和翻译水平中的表达（P<0.01）。本研究发现,CTSD的高表达能抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,改变颗粒细胞的周期进程;还能改变细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3与细胞周期相关因子Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E的表达;同时也能够极显著降低颗粒细胞中多胎性状候选基因与蛋白BMPR-IB、FSHR、INHA的表达量（P<0.01）。这提示,CTSD可能通过改变细胞水平相关因子的表达量来调控颗粒细胞的生物学行为以及影响山羊多胎性状候选基因的表达进而间接的成为影响山羊产羔性状的重要因子,本研究为进一步探明CTSD对山羊产羔性状调控机理及对颗粒细胞的影响机制奠定基础。     

藏羊HSP27基因过表达和沉默载体构建及对卵泡发育的功能初步分析

为了深入探究HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的作用,本研究选择健康的（3~4岁）经产藏母羊6只,屠宰获得卵巢组织进行藏羊HSP27基因克隆,利用生物信息学方法分析HSP27基因CDS区序列,构建HSP27基因过表达及沉默载体,分离培养藏羊卵巢颗粒细胞,将构建的载体按不同分组进行细胞转染试验即空白组、过表达载体组、沉默载体组、阴性对照组,每组设3个复孔。显微镜观察各转染组培养0、24、48、72 h的细胞形态变化及细胞计数,RT-PCR检测各转染组HSP27、GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量。结果,试验成功克隆藏羊HSP27基因,其CDS序列长度为618 bp,编码203个氨基酸。试验成功构建藏羊HSP27基因过表达及沉默载体;将构建的载体转染至卵巢颗粒细胞,随着培养时间的递增各转染组间细胞形态发生改变,过表达载体组细胞由长梭状逐渐变为不规则多边形,细胞核变形分解,沉默载体组细胞周边伪足伸出减少,细胞皱缩大量凋亡;细胞计数结果显示,转染后培养72 h时,沉默载体组细胞数量极显著低于其他3组（P<0.01）,过表达载体组细胞数量显著低于空白组和阴性对照组（P<0.05）。RT-PCR结果显示,过表达载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞HSP27基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）,过表达载体组细胞的GDF9、BMPR-1B、Erβ基因mRNA表达量均极显著高于空白组（P<0.01）,沉默载体组细胞Erβ基因mRNA表达量极显著低于阴性对照组（P<0.01）。由此可初步推测,当HSP27基因过表达时能够促进颗粒细胞增殖分化,当沉默HSP27基因时可能会触发颗粒细胞凋亡进而影响卵泡发育,以上研究成果可为HSP27基因在藏羊卵泡发育过程中的功能研究奠定试验基础。     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组（P<0.01）,输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组（P<0.05）,其他组织未达到差异显著性（P>0.05）。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组（P<0.05）,P4含量在12 h显著高于对照组（P<0.05）;超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用（P<0.05）,48、72 h达到极显著促进作用（P<0.01）,并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低（P<0.01）。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的克隆及其在各组织和不同生长阶段肝中的差异表达分析

旨在克隆牦牛胰岛素样生长因子结合蛋白4和5（insulin-like growth factor binding protein 4 and 5,IGFBP4 and IGFBP5）基因,并检测其在牦牛不同组织及不同生长阶段肝中的表达水平。本研究选取1日龄、15月龄和5岁龄健康雌性麦洼牦牛共9头（每组各3头）,体重分别约为（12.35±1.85）、（98.88±2.50）和（268.55±27.82） kg,采集5岁龄牦牛心、肝、脾、肺、肾、小肠组织及3个不同生长阶段牦牛肝组织。本试验克隆IGFBP4和IGFBP5基因,并对其序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法、Western blot技术与免疫组化技术检测其在5岁龄牦牛6种组织及1日龄、15月龄和5岁龄3个不同生长阶段肝中的表达差异。结果表明,获得牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的CDS序列分别为777和816 bp,分别编码258和271个氨基酸,GenBank序列号分别为MT012934和MT003005。在同源性比较中,牦牛IGFBP4和IGFBP5序列均与黄牛的同源性最高,分别为99.6%、99.5%。组织表达谱分析显示,IGFBP4和IGFBP5基因均在5岁龄牦牛肝中表达量最高,与肾、心、小肠、脾、肺相比差异极显著（P<0.01）,且6种组织中IGFBP4基因的表达量均极显著高于IGFBP5基因（P<0.01）。不同生长阶段肝中差异表达结果显示,随着年龄的增长,IGFBP4和IGFBP5的mRNA与蛋白水平在牦牛肝脏组织中的表达量均呈现上升趋势,即5岁龄>15月龄>1日龄,在5岁龄时表达量最高,与1日龄和15月龄均存在极显著差异（P<0.01）,且IGFBP4的表达量极显著高于IGFBP5（P<0.01）。结果提示,IGFBP4和IGFBP5可能协同调控牦牛肝的生长发育,这为深入研究IGFBP4和IGFBP5在牦牛肝生长发育过程中的作用以及表达调控提供了一定的基础数据。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

牦牛NGF基因克隆及其在生殖器官中的表达定位

旨在探究NGF基因的生物学特性及其在母牦牛生殖器官中的表达特性.本研究收集黄体期母牦牛的心、肝、脾、肺、肾以及胎牛期、卵泡期、黄体期、妊娠期母牦牛的卵巢、子宫和输卵管(n=3),利用RT-PCR克隆牦牛NGF基因,并对其序列进行生物信息学分析,利用RT-qPCR技术分析NGF基因的组织表达特性,利用免疫组化技术(IHC...     

牦牛FHL2基因的克隆、组织表达与蛋白定位分析

旨在获得牦牛FHL2基因序列，阐明该基因序列、蛋白质结构与性质、mRNA的组织表达模式、在雌性生殖器官及颗粒细胞的蛋白表达特性。本研究以5头健康空怀成年母牦牛的心、肝、脾、肺、肾、卵巢、子宫、输卵管组织及5头妊娠2个月左右母牦牛的子宫、输卵管和卵巢为研究材料，利用逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆FHL2基因，并使用在线分子生物学软件分析其生物信息学特性；利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析FHL2基因的组织表达特性；应用免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)技术检测FHL2蛋白在雌性生殖器官的分布和颗粒细胞上的亚细胞定位。结果发现，FHL2基因CDS区全长840 bp (ON456866),编码279个氨基酸，FHL2蛋白属于弱碱性亲水不稳定蛋白，没有跨膜结构。不同物种的FHL2氨基酸序列比对和进化树分析表明，FHL2基因编码区在物种进化中比较保守。RT-qPCR结果显示，FHL2基因在检测的组织都有表达，在心的表达量极显著高于其他检测组织(P<0.01);在肺、卵巢、输卵管和子宫中的表达量极显著高于肝、脾和肾(P<0.01)。FHL2基因在妊娠期子宫中的表达...     

牦牛RBM3的基因克隆及其在不同繁殖时期卵巢、输卵管、子宫中的表达定位

旨在研究RBM3在牦牛(Bos grunniens)生殖相关调控中的作用。本研究以卵泡期、黄体期和妊娠期4~6岁健康雌性牦牛各3头为采集对象，采集其卵巢、子宫和输卵管共9组试验样品，每组设置3个生物学重复。利用基因克隆技术克隆牦牛RBM3基因并进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)分别在基因层面和蛋白层面检测RBM3在牦牛子宫、卵巢和输卵管中的相对表达量；利用免疫组织化学(immunocytochemistry,IHC)方法检测RBM3蛋白在试验样品中的分布定位。牦牛RBM3基因(GenBank No.:MF142258.1)被成功克隆并预测出二、三级结构，发现其与野牦牛亲缘性最近，基因编码区第51位、98位核苷酸不同于常见哺乳动物，生物信息学分析预测其编码的蛋白质为稳定的非跨膜蛋白。RBM3蛋白在本试验9组样品的表达量有如下差异：在卵巢中，黄体期显著高于卵泡期和妊娠期(P＜0.05)；输卵管中，卵泡期显著低于黄体期和妊娠期(P＜0.05)；子宫上，卵泡期显著高于黄体期和妊娠期(P＜0.05)。免疫组织化学结果显示，RBM3在卵巢中的主要表达位置是卵泡膜、颗粒层和黄体细胞；在输卵管的表达位置是黏膜上皮；子宫上的表达主要以子宫内膜和子宫腺为主。本研究结果提示，RBM3可能参与牦牛个体发情周期和妊娠过程的调控以及妊娠识别等过程，为RBM3这一冷应激调节因子参与牦牛对高原环境的适应性生理机制方面的研究提供参考。     

Expression and Localization of Integrin αv in Different Parts of the Fallopian Tube in Reproduction Cycle of Yak

The objective of this study was to explore the expression differences of integrin αv in different parts of the fallopian tube at different reproduction stages of yak, and provide some important theoretical foundations for understanding the effect of integrin αv on the reproductive performance of yak. The samples of the tubal umbrella, ampulla, and isthmus of healthy female yaks (3-6 years old) during follicular, luteal and pregnancy stages were collected, the fallopian tubes of the follicular phase, the luteal phase and the pregnancy phase were divided into 9 groups according to the umbrella, ampulla and isthmus. Real-time PCR (qRT-PCR) and Western-blotting (WB) were used to detect the expression of integrin αv gene and protein. The expression of integrin αv protein was localized by immunohistochemistry. Results: 1) qRT-PCR results showed that, during the follicular phase, the expression of the integrin αv gene in the umbrella of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the ampulla and isthmus (P<0.01). During the luteal phase, the expression of the integrin αv gene in the isthmus of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the umbrella and ampulla (P<0.01). During the pregnancy phase, the expression of the integrin αv gene in the umbrella of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the ampulla and isthmus (P<0.01). 2) Western-blotting results showed that, during the follicular phase, the expression of integrin αv protein in the umbrella of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the ampulla and isthmus (P<0.01). During the luteal phase, the expression of integrin αv protein in the isthmus of the fallopian tube was the highest and extremely significantly higher than those in the umbrella and ampulla (P<0.01). During the pregnancy phase, the expression of integrin αv protein in tubal isthmus and umbrella was not significantly different, but these were extremely significantly higher than that in the ampulla (P<0.01). 3) The results of immunohistochemistry showed that integrin αv protein was positively expressed in ciliated cells, secretory cells, basal cells, muscular layers and serous glands of the fallopian tube umbrella, ampulla and isthmus. The results indicated that the expression of integrin αv in different parts of the fallopian tube at different reproduction stages of the yak were significantly different, which showed that αv might be involved in a series of reproductive processes such as fertilization and early embryonic development, the results provided basic information for the study of yak's reproductive performance.     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

Cloning,Bioinformatics and Tissue Differential Expression Analysis of PRDM16 Gene in Qinghai Plateau Yak

In this study,the part coding region of PRDM16 gene of the Qinghai plateau yak was cloned and its bioinformatics and differential expression of PRDM16 gene of muscle tissue were analyzed in different sex individual.The PRDM16 gene part of CDS region was cloned from the longissimus dorsi muscle tissue of Qinghai plateau yak,analyzed its characteristics of bioinformatics and detected gene expression levels of different sex individuals in muscle tissue by Real-time PCR.The results showed that the sequence length of the cloned fragment was 323 bp,the homology between Qinghai plateau yak and cattle was 100%.It encoded 99 amino acids,containing domains of MDS1-EVI1 (complex locus protein MDS1) family proteins function,CATH protein function and typical structure of the curly spiral.PRDM16 protein was 20% of the similarity with people methyltransferase protein domain PR protein 1.PRDM16 gene expression of female yak was significantly higher than male yak's in longissimus dorsi muscle tissue (P<0.01).The test results provided not only research foundation for genetic progress but also technical references for yak meat quality analysis.     

青海高原牦牛PRDM16基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

本研究对青海高原牦牛PRDM16 (PR domain containing 16)基因部分编码区进行克隆及生物信息学分析,同时对PRDM16基因在雌、雄牦牛背最长肌肌肉组织中的表达差异进行了分析.选取雌、雄青海高原牦牛各5头,屠宰后采集背最长肌肌肉组织,克隆牦牛PRDM16基因部分CDS区序列,分析其生物信息学特征;应用实时荧光定量PCR技术检测PRDM16基因在雌、雄牦牛肌肉组织中表达水平.结果显示:克隆所得片段序列长323 bp,与黄牛同源性为100%,编码99个氨基酸,具有MDS1-EVI1(complex locus protein MDS1)家族蛋白功能,具有CATH蛋白功能活性,包含卷曲螺旋等典型结构域,与人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白1有20%的相似性;PRDM16基因在雌性牦牛肌肉组织中表达水平极显著高于雄性牦牛(P<0.01).本试验结果为进步一研究青海高原牦牛PRDM16基因奠定了基础,为牦牛肉品质分析提供参考.