苜蓿基因工程研究进展

紫花苜蓿是世界上栽培最早、分布最广,也是最优良、最重要的一种优质豆科牧草,素有"牧草之王',之美称.由于苜蓿在世界畜牧业中的重要性,苜蓿基因工程研究要早于其它牧草.特别是最近几年来,基因工程手段已经被广泛应用于苜蓿的研究中,并取得了一些重要成果.本文综述了在苜蓿遗传转化方法、抗生物胁迫和非生物胁迫、品质改良、生物反应器和共生固氮等基因工程方面的国内外进展,着重阐述了基因工程在提高苜蓿抗性、改良品质和研究共生固氮调控机制方面的作用并就苜蓿基因工程研究今后的发展方向做了展望.     

雌性牦牛主要生殖器官中DBI的表达与定位分析

为加深对DBI基因功能的探究,揭示其在牦牛生殖生理过程中的作用.本试验采集健康母牦牛(3～6岁)繁殖周期不同阶段(卵泡期、黄体期和妊娠期)的卵巢、输卵管和子宫组织,共分为9组,每组设置3个生物学重复.采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白免疫印迹技术(Western blotting,WB)检测牦牛DBI在繁...     

紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系的建立

以我国农艺性状优良的丰产紫花苜蓿Medicago sativa品种大叶苜蓿和甘肃省广为种植的优质紫花苜蓿品种陇东、陇中、甘农1号、甘农3号等的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体研究了不同培养基、激素配比以及脯氨酸、蔗糖和活性炭对紫花苜蓿胚性愈伤组织和体细胞胚诱导分化的影响,结果表明:最佳胚性愈伤诱导培养基为MS 2,4-D 5 mg/L KT 1 mg/L;最佳外植体为下胚轴。最佳体细胞胚诱导和分化培养基为SH;脯氨酸对体细胞胚的诱导分化无明显作用;在培养基中添加活性炭会降低体细胞胚诱导率;蔗糖浓度为20 g/L时体细胞胚诱导率最高。同时还建立了紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系,为根癌农杆菌介导AtNHX1基因对紫花苜蓿的遗传转化打下了坚实的基础。     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化紫花苜蓿的研究

在已建立的紫花苜蓿Medicogo sativa体细胞胚高频再生体系的基础上,研究了OD600、侵染时间、负压处理、预培养及共培养时间、脱菌及选择方法等因子对转化效率的影响,并初步获得了抗性体胚。     

液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白与植物耐盐性

土壤盐碱化作为一种主要的非生物胁迫因子严重影响着世界范围内的农业生产。植物抵御盐胁迫的有效策略之一是将细胞质中过多的Na^＋区隔化在液泡,这一过程是由液泡膜Na^＋／H^＋逆向转运蛋白完成的。本文概述了植物液泡膜Na^＋／H^＋逆向转运蛋白的分子结构、功能、表达调控及其与植物耐盐性的关系等方面的研究进展,并对未来几
年该蛋白的主要研究方向作了分析和展望。     

外源添加17β-雌二醇对牦牛输卵管上皮细胞DBI表达的影响

地西泮结合抑制因子(Diazepam binding inhibitor, DBI)在动物组织广泛表达,与细胞脂肪酸代谢密切相关,而脂肪酸参与早期胚胎发育能量供应。为研究其介导的母源分泌因子调控牦牛输卵管上皮细胞物质代谢和哺乳动物早期胚胎能量供给之间的潜在生物学作用。本试验通过分离并建立牦牛输卵管上皮细胞体外培养体系,培养过程中添加不同浓度外源性17 β-雌二醇（0、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10mol/L）,作用不同时间后(0、6、12、24、48、72 h)。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)、蛋白免疫印迹方法（Western blotting,WB）和免疫荧光技术(Immunofluorescence, IF)从基因和蛋白水平分别检测不同浓度17 β-雌二醇对输卵管上皮细胞DBI表达的影响。试验成功建立了原代牦牛输卵管上皮细胞分离与培养体系：输卵管上皮细胞接种密度4×105个/mL,DMEM/F12 培养基+10% FBS+100 U·mL-1链霉素+100 U·mL-1青霉素,24h换液一次,细胞的纯度高达90％以上;1×10-7mol/L 17 β-雌二醇作用牦牛输卵管上皮细胞6h时,DBI基因和蛋白表达水平最高,其它各处理组DBI表达水平降低,免疫荧光显示各处理组输卵管上皮细胞的细胞核和细胞质均可表达DBI蛋白。结果表明：17 β-雌二醇参与调控牦牛输卵管上皮细胞DBI的表达,并且具有剂量依赖性和时间差异性,为进一步探索母源细胞因子调控输卵管上皮细胞的多重生物学机制提供了关键科学突破点。     

牦牛卵母细胞体外成熟培养及孤雌发育研究

牦牛体外胚胎培养作为辅助生殖策略，能够有效提高其繁殖能力。为研究牦牛卵母细胞体外培养过程中不同的处理方式对孤雌激活胚胎发育质量的影响，10月份采集5～8岁健康母牦牛卵巢，抽吸法收集卵母细胞进行体外成熟诱导，设置卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexs,COCs）和裸卵2个试验组；TCM199培养时间分别为24、36 h；以及体外培养12 h的COCs，消化之后再移入TCM199培养12 h）分别进行孤雌激活，在体外进行孤雌胚胎培养，统计卵裂率和囊胚率。结果显示，牦牛COCs的孤雌激活胚胎发育率显著低于裸卵（P<0.05），且后期出现脱卵丘细胞现象；COCs在TCM199中培养24 h的孤雌胚胎卵裂率明显高于培养36 h的处理组（P<0.05）；裸卵再培养之后卵母细胞成熟率低、进行孤雌激活的卵裂率极低，且大部分发生贴壁。以上结果表明，体外培养24 h的COCs经透明质酸酶消化为裸卵的孤雌激活效果最佳，其卵裂率最高，囊胚率最高。研究结果为揭示牦牛卵母细胞孤雌激活前的不同处理方式与孤雌激活胚胎的发育质量提供了依据，可为优化卵母细胞体外培养、提高孤雌激活...