不同胚龄皮质酮处理对鸡胚胎生长发育的影响

本试验通过不同胚龄鸡胚外源皮质酮处理,研究外源皮质酮对鸡胚生长发育及出雏效果的影响,初步探索肉鸡代谢程序化效应。700枚质量相近的AA肉鸡种蛋,分3个不同时间进行卵黄囊重复注射：孵化前注射（E0）;7胚龄注射（E7）;14胚龄注射（E14）;每一时间点分200 ng皮质酮处理组和玉米油正对照组,并设定负对照组1个。21胚龄记录出雏时间、出雏率、出雏重、屠宰器官质量,并测定雏鸡血浆中血糖、尿酸和甘油三酯含量。结果表明：0胚龄皮质酮处理显著降低了孵化率（P〈0.05）,增加了胚胎的死亡率;7胚龄200 ng皮质酮处理组缩短了孵化时间（P〈0.05）,并有降低孵化率的趋势,鸡胚胎的心脏、肝脏的发育受到了抑制（P〈0.05）。研究表明皮质酮的处理效应与注射胚龄有关,此外注射本身也会对胚胎的发育和物质代谢造成一定的影响。     

奶牛半胚裸露冷冻保存试验报告

本试验研究了不同冷冻方法、半胚冷冻前不同培养时间及不同冷冻保护液对奶牛7日龄半胚裸露冷冻效果的影响。结果以10％（V／V）甘油＋10％（W／V）葡聚糖（T－500）＋0．1M蔗糖／20％FCS－PBS溶液为冷冻保护液，裸露冷冻冻前培养1．0小时的半胚，获得了82．4％（14／17）的较高存活率，试验结果表明，半胚冷冻前培养时间及不同保护淮对奶牛半胚裸露冷冻有显著影响。     

山羊早期胚胎发育的初步研究

本实验以黑龙江地方山羊为材料,经FSH超数排卵后,在不同时间屠宰母山羊,并冲洗输卵管及子宫,获取新鲜卵及各发育时间的胚胎。实验中发现山羊的排卵时间为发情开始后约30小时。受精卵的第一次卵裂的发生在排卵24小时以后。2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、桑椹及胚泡期胚胎所处的时间分别为排卵后约32～42、48～52、62、72、96小时以及7～8天。16细胞期以前的胚胎移行于输卵管中,桑椹胚及胚泡则移行于子宫中。在每一时间从每只羊中所收集的胚胎基本上处于几个相邻的发育时期。在桑椹胚的动物极有明显的突起,这可能是内细胞群已开始形成的标志。到胚泡期时,胚胎体积增大,透明带变薄。正在孵化或已经孵化的胚泡中,内细胞群外端无滋养层细胞包围。     

鸡传染性支气管炎病毒M41株鸡胚增殖工艺研究

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41标准毒株在鸡胚上的最佳生产工艺,试验用IBV M41株分别以不同剂量接种同一胚龄不同鸡胚、不同胚龄普通鸡胚,以及IBV M41株接种普通鸡胚后不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备病毒液的产量及病毒效价。结果显示:IBV M41株接种无传染性支气管炎病毒母源抗体的SPF鸡胚最佳病毒接种剂量为104.5EID50,接种含有IBV母源抗体的普通鸡胚最佳病毒接种剂量为105.1EID50,最佳接种胚龄为11日胚龄,最佳收毒时间为48 h。按照此工艺制备疫苗,免疫SPF鸡,IBV抗体效价均符合规程标准。研究结果为用鸡胚高效、大量生产IBV M41株病毒抗原进而生产合格的IB疫苗提供了数据支持。     

鸡肾型传染性支气管炎(HK株)活疫苗生产条件的探讨

采取不同浓度的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)接种不同日龄的鸡胚,在不同时间内收获鸡胚液。根据收获时鸡胚的死亡情况、胚液的收获量及胚液的病毒含量,优选IBV活疫苗生产的最佳条件。结果表明,将IBV调整为102.0~103.0EID50/0.1ml,尿囊内接种于12日龄鸡胚中,每胚0.1ml,37℃孵育33h收获,胚液的产毒量和收获量最高。     

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。     

一株H9N2亚型禽流感病毒鸡胚培养工艺研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚上最佳培养工艺,试验采用H9N2亚型禽流感病毒分离株以不同稀释倍数接种不同鸡胚(SPF及普通鸡胚)、不同日龄鸡胚及不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备出的鸡胚尿囊液的产量及病毒效价。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒接种无禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~(4 )～1×10~5倍,接种带有禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~3～1×10~4倍,最佳接种日龄为10日龄,最佳培养时间为96～120 h。说明采用优化的鸡胚培养方法生产H9N2亚型禽流感病毒可以得到高质量、高产量的病毒液。     

奶牛半胚裸露冷冻保存试验

本试验研究了不同冷冻方法，半胚冷冻前不同培养时间及不同冷冻保护液对奶牛７日龄半胚裸露冷冻效果的影响，结果以１０％（Ｖ／Ｖ）甘油＋１０％（Ｗ＋Ｖ）葡聚糖（Ｔ－５００）＋０．１Ｍ蔗糖＋２０％ＦＣＳ－ＰＢＳ溶液为冷冻保护液，裸露冷冻前培养１．０小时的半胚，获得了８２．４％（１４／１７）的较高存活率。试验结果表明，半胚冷冻前培养时间及不同保护液对奶牛半胚裸露冷冻有显著影响。     

供体牛采卵后不同清宫处理方法的效果分析

本文选用采卵后鉴定为子宫炎的供体母牛,用土霉素、土霉素和前列腺素(PG)、清宫液3种治疗方案对子宫炎供体牛进行了治疗.对采卵的处理情况和后续的子宫卵巢机能恢复后再配种受胎情况,冲胚时间至治疗后第1次发情时间,冲胚时间至受胎时间进行了临床效果观察.结果表明:土霉素和PG组与土霉素组、清宫液组差异显著(P＜0.05).土霉素和PG组与土霉素组、清宫液组相比,子宫炎供体牛治疗后出现首次发情和冲胚至受胎时间明显缩短,首次出现发情分别平均缩短1.56 d、3.27 d,冲胚至受胎时间分别平均缩短10.25 d、12.39 d.     

淫羊藿种子变温层积过程中胚形态及生理生化变化

为探究变温层积过程中淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim.)种子胚形态及生理生化的变化规律，为淫羊藿种子变温层积提供理论依据，本研究对淫羊藿种子进行变温层积处理(1～90 d为20～25℃，91～150 d为4℃)，观测不同层积温度下，种胚形态、胚率、营养物质含量、呼吸途径关键限速酶活性及内源激素随着时间的变化规律。结果表明，在层积过程中，淫羊藿种子胚形态从球形胚逐渐发育为心形胚，最后为子叶胚，胚率显著升高，变温层积有利于胚形态发育。营养物质的相互转化为种子的形态生理后熟提供能量和物质基础，淀粉是该过程中的主要供能物质，赤霉素(Gibberellin，GA)、吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)的变化趋势与种子发育进程密切相关，可能有效促进了种子形态后熟。     

干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究

为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicago sativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101 感染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先置于含10 mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14 d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7 d,最后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。     

紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系的建立

以我国农艺性状优良的丰产紫花苜蓿Medicago sativa品种大叶苜蓿和甘肃省广为种植的优质紫花苜蓿品种陇东、陇中、甘农1号、甘农3号等的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体研究了不同培养基、激素配比以及脯氨酸、蔗糖和活性炭对紫花苜蓿胚性愈伤组织和体细胞胚诱导分化的影响,结果表明:最佳胚性愈伤诱导培养基为MS 2,4-D 5 mg/L KT 1 mg/L;最佳外植体为下胚轴。最佳体细胞胚诱导和分化培养基为SH;脯氨酸对体细胞胚的诱导分化无明显作用;在培养基中添加活性炭会降低体细胞胚诱导率;蔗糖浓度为20 g/L时体细胞胚诱导率最高。同时还建立了紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系,为根癌农杆菌介导AtNHX1基因对紫花苜蓿的遗传转化打下了坚实的基础。     

苜蓿原生质培养及体细胞杂交技术的应用

阐述了植物原生质体培养和体细胞杂交技术以及苜蓿Medicago spp.体细胞胚胎发生特性,综述了该技术在苜蓿育种研究中的应用状况,同时介绍了我国苜蓿研究领域原生质体培养和体细胞杂交技术的研究进展.     

苜蓿组织培养体细胞胚发生体系的建立

采用17个农艺性状优良的苜蓿Medicago sativa丰产品种,诱导体细胞胚发生,结果表明:苜蓿无菌苗子叶在含有2.0 mg/L 2,4-D和0.25 mg/L KT的MS培养基(有机物质有改变)上诱导出愈伤组织;愈伤组织在含有0.05 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA的MS培养基上形成胚性愈伤组织,并伴随着体细胞胚的发生;发育到子叶期的体细胞胚在不加任何激素的MS培养基上就可以萌发,再生成完整植株。     

黄花苜蓿高频植株再生体系建立的研究

黄花苜蓿（Medicago falcataL.）具有较强的抗逆性,是苜蓿育种重要的种质资源。进行黄花苜蓿功能基因研究,有必要建立其高效的植株再生体系。以新疆野生黄花苜蓿的子叶和下胚轴为外植体,以N6大量,MS微量及铁盐,水解酪蛋白2.0g·L^-1,维生素VB₁9.9mg·L^-1,VB₆9.5mg·L^-1,尼克酸4.5mg·L^-1,琼脂8.0g·L^-1和蔗糖30g·L^-1等成分为基本培养基,通过比较不同激素配比对黄花苜蓿愈伤诱导率和体细胞胚发生率的影响,优化并建立了黄花苜蓿的高频再生体系。优化的培养基激素配比为：愈伤诱导和保持培养基添加2,4-D 3.0mg·L^-1+KT 0.05mg·L^-1;分化培养基添加KT 0.4mg·L^-1,蔗糖浓度调整为20g·L^-1;生根培养基为1/2MS+蔗糖15g·L^-1+琼脂8.0g·L^-1。在优化培养流程下,新疆野生黄花苜蓿子叶愈伤诱导率可达92%,下胚轴可达95%,体细胞胚发生率可达54%,体细胞胚萌发成苗率为76%。再生周期约为70～80d。     

苜蓿花药悬浮培养体系的建立及其影响因素

苜蓿(Medicago sativa L.)花药悬浮培养体系的建立可为苜蓿体细胞杂交、遗传转化以及获得苜蓿单倍体,建立苜蓿加倍单倍体群体(DH)提供快捷有效的途径。采用固-液培养基结合的方式建立苜蓿花药悬浮培养体系,通过探索体系建立的基础条件及其影响因素,可建立适宜的苜蓿花药悬浮培养体系。结果表明,苜蓿悬浮培养体系中,基本液体培养基为NB培养基,培养液最佳组合为NB+2,4-D 0.3 mg·L^-1+NAA 0.3 mg·L^-1,蔗糖2%;建立苜蓿花药悬浮细胞系,应选取淡黄色或乳白色,结构疏松,颗粒状胚性愈伤组织为悬浮培养的基础材料;苜蓿花药悬浮细胞系继代周期为6~8 d;苜蓿花药悬浮培养时初始接种量为2g/30mL时悬浮细胞PCV、鲜重以及干重的增殖倍数最高,增殖倍数均超过4倍;植物生长调节剂2,4-D的添加浓度以0.3 mg·L^-1为宜;糖作为组织培养过程中唯一的碳源,在苜蓿细胞悬浮培养体系中应有一定的浓度范围。因此,苜蓿花药悬浮培养中,蔗糖浓度为2%-3%时效果最好。     

共培养消除次黄嘌呤对胚胎发育的抑制作用

将昆明小鼠原核胚分别与不同贴壁程度的山羊原代输卵管上皮细胞（oviductal epithelial cells，OECs）共培养，确定体细胞的贴壁程度对共培养胚胎发育的影响。然后，采用高压液相色谱仪（HPLC）测定培养液中次黄嘌呤（hypoxanthine，HX）浓度，确定不同贴壁程度体细胞降解HX的能力。结果表明：与山羊原代0ECs共培养，能很好地促进小鼠胚胎发育，发育到囊胚的比例约为60％，其中贴满1d组的胚胎发育效果最好。在此基础上，检测培养液中HX浓度，发现贴满1d组培养液中HX浓度显著低于贴满3d和5d组（P〈0．05），表明体细胞降解HX的能力随培养时间的延长而下降。     

多叶苜蓿自交S1代的胚挽救培养

以苜蓿(Medicago sativa)多叶性状S1代的3个单株为材料,研究了3份参试材料的败育率,测定了开展胚挽救培养的最佳取材时间和不同激素水平对苜蓿自交系胚挽救的影响。结果表明,参试材料平均败育率为37.59%;进行苜蓿胚挽救培养的最佳取样时间为授粉后30 d;胚挽救培养的最佳培养基配方为MS+0.5 mg/L IAA +0.07 mg/L 6 BA,蔗糖30 g/L,琼脂7 g/L,pH值5.8～6.1。对萌动的胚进行愈伤组织诱导发现,参试材料平均诱导率为85.32%,愈伤组织平均分化率为75.66%。研究以期为苜蓿胚挽救育种提供理论基础,并为苜蓿特异性状自交系结实率低等方面的研究提供有效的解决途径。     

4个苜蓿品种愈伤组织诱导对光照的响应及再生体系建立

为实现苜蓿(Medicago sativa)的遗传改良,建立稳定、高效的离体培养再生体系,以甘农1号、巨人、WL324和三得利4个苜蓿品种为试验材料,以下胚轴为外植体,MS、UM、改良HS、改良UM为基本培养基,分别添加2,4-D、KT和水解酪蛋白诱导愈伤组织,通过体细胞胚发生途径建立再生体系,研究光照对苜蓿愈伤组织诱导及愈伤组织形态对体细胞胚发生的影响。结果表明,光照对愈伤组织诱导率差异不显著,均为100%;光暗交替条件下诱导的愈伤组织褐化率高、生长更快、更旺盛,颜色稍显绿或黄绿相间。在不同光照条件下4个苜蓿品种诱导的愈伤组织,以甘农1号的体细胞胚发生率最高,为20.83%~56.25%,而且光暗交替条件下诱导的愈伤组织更易形成体细胞胚;不同培养基中,UM+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT下体细胞胚发生率最高,为56.25%。     

苜蓿体细胞胚发生的影响因素

在组织培养过程中诱导苜蓿体细胞胚发生的关键因素有两个：一是植物材料，包括基因型和外植体类型；二是培养基成分。研究结果认为：紫花苜蓿体细胞胚发生能力较强，无菌苗子叶和下胚轴是发生率较高的外植体；2．0mg／L的2,4-D补加适宜浓度的NAA、KT和BA等激素是相对平衡的激素组合，也是必需的。添加一些有机物有利于提高体细胞胚发生率。