4个苜蓿品种愈伤组织诱导对光照的响应及再生体系建立

为实现苜蓿(Medicago sativa)的遗传改良,建立稳定、高效的离体培养再生体系,以甘农1号、巨人、WL324和三得利4个苜蓿品种为试验材料,以下胚轴为外植体,MS、UM、改良HS、改良UM为基本培养基,分别添加2,4-D、KT和水解酪蛋白诱导愈伤组织,通过体细胞胚发生途径建立再生体系,研究光照对苜蓿愈伤组织诱导及愈伤组织形态对体细胞胚发生的影响。结果表明,光照对愈伤组织诱导率差异不显著,均为100%;光暗交替条件下诱导的愈伤组织褐化率高、生长更快、更旺盛,颜色稍显绿或黄绿相间。在不同光照条件下4个苜蓿品种诱导的愈伤组织,以甘农1号的体细胞胚发生率最高,为20.83%~56.25%,而且光暗交替条件下诱导的愈伤组织更易形成体细胞胚;不同培养基中,UM+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT下体细胞胚发生率最高,为56.25%。     

紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究

离体培养条件下对紫花苜蓿地方栽培品种--陇东苜蓿、和田苜蓿、准格尔苜蓿以及引进品种Rambler苜蓿植株不同部位的再生进行了研究,结果表明,不同的苜蓿品种、外植体、外源激素种类及其浓度等因素均影响着植株的再生.陇东苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率和体细胞胚形成率最高可达91.04%和63.75%;和田苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率最高可达92.05%,体细胞胚形成率最高为56.82%.这2个品种在紫花苜蓿的组织培养植株再生中是较理想的试验材料;紫花苜蓿下胚轴是理想的受体材料.苜蓿愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成以2.0 mg/L 2,4-D处理2周为最佳;在2.0 mg/L 2,4-D 0.5～2.0 mg/L 6-BA的作用下,外植体产生愈伤组织以及进一步发育的趋势较强.对体细胞胚的发育和幼苗的形成则以2.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA的激素组合进行处理.适宜的生根培养基为1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.7%琼脂.     

紫花苜蓿基因转化的影响因素分析

通过农杆菌介导法对紫花苜蓿不同品种植株进行了抗旱基因转化的研究,得到了一套紫花苜蓿基因转化的优化体系。研究表明,100 mg/L的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长有着显著的抑制效应。250 mg/L头孢霉素能够有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长。紫花苜蓿供试材料被切后直接用OD600值为0.3~0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染10~15 min;培养材料共培养3 d后在愈伤组织诱导培养基MS 2 mg/L 2,4-D 0.5 mg/LKT 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 250 mg/L Cef上诱导出愈伤组织;在体细胞胚分化培养基MS 1.0 mg/L BA 0.3 mg/L NAA 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 50 mg/L Kan 250 mg/L Cef上促进体细胞胚的分化;分化出的体细胞胚在再生培养基上(同分化培养基,Kan为80 mg/L)进一步发育成抗性转化苗;转化的无根小苗在生根培养基1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.8%琼脂 100 mg/L卡那霉素上可生长出根系。     

紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系的建立

以我国农艺性状优良的丰产紫花苜蓿Medicago sativa品种大叶苜蓿和甘肃省广为种植的优质紫花苜蓿品种陇东、陇中、甘农1号、甘农3号等的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体研究了不同培养基、激素配比以及脯氨酸、蔗糖和活性炭对紫花苜蓿胚性愈伤组织和体细胞胚诱导分化的影响,结果表明:最佳胚性愈伤诱导培养基为MS 2,4-D 5 mg/L KT 1 mg/L;最佳外植体为下胚轴。最佳体细胞胚诱导和分化培养基为SH;脯氨酸对体细胞胚的诱导分化无明显作用;在培养基中添加活性炭会降低体细胞胚诱导率;蔗糖浓度为20 g/L时体细胞胚诱导率最高。同时还建立了紫花苜蓿体细胞胚高频再生体系,为根癌农杆菌介导AtNHX1基因对紫花苜蓿的遗传转化打下了坚实的基础。     

黑麦冬牧70幼穗和未成熟胚愈伤组织诱导及植株再生

将黑麦冬牧70幼穗切段和未成熟胚接种在附加不同激素浓度的改良MS培养基上培养,获得了能多次继代培养的愈伤组织,后者在分化培养基上再生植株.2,4-D和6-BA浓度明显影响愈伤组织质量和诱导率,幼嫩幼穗和较小的未成熟胚愈伤组织诱导率高.幼穗切段在改良MS 1.0 mg/L 2,4-D 200 mg/L谷氨酰胺的培养基上愈伤组织诱导率最高,质量较好;未成熟胚在改良MS 2.0 mg/L 2,4-D 0.1 mg/L 6-BA 200 mg/L谷氨酰胺的培养基上愈伤组织诱导率最高,质量最好.继代培养后的愈伤组织转移到附加200 mg/L谷氨酰胺、1.0 mg/L 2,4-D和0.1 mg/L TDZ的培养基上可分化出大量小芽.该体系可用于黑麦冬牧70遗传转化和细胞工程育种研究.     

不同激素和外植体对柱花草愈伤组织诱导及体细胞胚的影响

以MS为基本培养基,以柱花草无菌苗的幼根、下胚轴、子叶、茎和真叶为材料,采用正交设计方法,研究不同外植体和激素对柱花草愈伤组织诱导和体细胞胚的影响。结果表明:外植体类型及2,4-D、KT、NAA、6-BA浓度对愈伤组织诱导率的影响均达极显著水平(P0.01),其中2,4-D浓度是最主要的影响因素,其次为外植体类型。下胚轴和真叶为柱花草愈伤组织诱导的理想外植体,愈伤诱导培养基的最优配方为MS+1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT+0.01mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA。NAA、6-BA浓度对柱花草体细胞胚产生率的影响达极显著水平(P0.01),NAA浓度是主要影响因素,体细胞胚产生的最佳培养基配方为MS+1.0mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+2.0g/L CH。     

松南结缕草成熟胚愈伤组织的诱导和再生

松南结缕草成熟种子经灭菌和打破休眠后,接种于含有不同浓度2,4-D的MS和N6培养基上进行愈伤组织诱导。结果表明,结缕草种子的休眠主要在于破除种壳。2,4-D浓度在2~5 mg/L对愈伤组织诱导率无明显影响。基本培养基MS和N6诱导效果相近,初生愈伤组织为白色、半透明,质地松软、水浸状。继代培养基中添加一定浓度的甘露醇、麦芽糖和ABA以及延长继代时间有助于愈伤组织的胚性化。基本培养基MS更适于结缕草初生愈伤组织致密胚性化。胚性愈伤组织在MS添加0.1 mg/L 2,4-D培养基上即可分化出大量具有根和茎叶的再生植株。     

中华结缕草组织培养与植株再生

以中华结缕草成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织的发生进行植株再生。结果表明,中华结缕草成熟胚在MS基本培养基附加6~7 mg/L 2,4-D和0.05 mg/L 6-BA的出愈能力很强,但初生愈伤组织呈无定型棉絮状,不能再生成株。采用不同的糖类和固化剂以及一定比例的生长素与细胞分裂素的方法,对初生愈伤组织进行继代培养,诱导出致密颗粒状的、具有高度再生能力的胚性愈伤组织,此类胚性愈伤组织在最佳分化培养基MS 1.0mg/L NAA 1.0 mg/L KT 3.00 mg/L 6-BA上有较高再生频率,生根培养基采用1/2 MS。     

蒙农杂种冰草成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生

以蒙农杂种冰草成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织的诱导进行植株再生,结果表明:在附加甘露醇(0.2mol/L)和2,4-D(2.0mg/L)的MS培养基中,冰草成熟胚可诱导产生愈伤组织,诱导率为87.6%,但质量较差;将其在降低2,4-D浓度和添加6-BA的继代培养基中继代改造,可明显改善愈伤组织质量,增加胚性愈伤;将筛选改良的愈伤组织置于分化培养基MS+ZT(3.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)中,分化率为82%;分化小苗在1/2MS培养基上可生根并得到完整植株.本研究还建立了一套有效的以成熟胚为外植体的蒙农杂种冰草组织培养再生体系.     

紫花苜蓿组织培养再生体系的建立

以紫花苜蓿无菌苗的下胚轴、子叶、叶片和叶柄为外植体,研究了不同培养基、不同激素种类和配比对胚性愈伤组织诱导的影响以及不同分化培养基对胚状体分化的影响.结果表明:下胚轴外植体胚性愈伤组织诱导率最高;最佳胚性愈伤组织诱导培养基为改良SH 2.0mg/L 2,4-D 0.5 mg/L 6-BA;最佳胚状体诱导培养基为MSO 2.0 mg/L 6-BA 0.5mg/L NAA;成苗培养基为1/2 MS 1% 蔗糖 0.7%琼脂.     

多年生黑麦草组织培养与植株再生研究

对多年生黑麦草种子为外植体的植株再生过程进行系统研究,结果表明,在改良的MS培养基(MSM),以MS无机盐+9.9mg/L维生素B₁+9.5mg/L维生素B₆+4.5mg/L尼克酸+1mg/LCH+30g/L蔗糖+琼脂8g/L为基本成分,附加5mg/L2,4-D和0.05mg/LKT时,适合种子的愈伤组织诱导;继代培养基附加2mg/L2,4-D和0.1mg/LKT;分化培养基附加1mg/L2,4-D和1mg/LKT;生根培养基为无激素的MS培养基。完成植株再生约需12周,愈伤组织分化率为70%。     

羊草幼穗离体培养诱导植株再生的研究

采用离体培养方法首次获得羊草体细胞再生植株。其方法要点是:取羊草幼穗为外植体,经0.1%HgCl₂溶液表面消毒后,接种到含2mg/L2,4-D的MS培养基上,置于恒温25℃条件下诱导愈伤组织。在加有1mg/L2,4-DMS培养基上继代2次后,转移到含1.0mg/LKT和0.5mg/LNAA的MS培养基上分化培养得到再生芽。在无激素的基本培养基上获得了生根的试管苗,试管苗移栽到温室后生长正常。研究结果还表明,尽管从羊草叶片、幼穗和成熟胚在同样培养条件下均能诱导出愈伤组织,但只有幼穗愈伤组织能够继续分化出再生植株。羊草试管苗的分化因基因型和外源激素的不同而异。     

紫花苜蓿离体培养植株再生及其RAPD分析

对苜蓿(品种农宝)的下胚轴外植体进行离体培养建立了再生体系。结果表明,子叶和下胚轴切段在附加0.2~1.0 mg/L IAA和2.0 mg/L 6-BA或2.0 mg/L KT的MS培养基上培养,均能诱导出愈伤组织,但子叶所诱导的愈伤组织不具有分化能力。下胚轴切段培养5~7 d即可诱导出愈伤组织,并分化出绿色芽点,在原培养基上进而可分化出大量的丛生芽。在含0.2 mg/L IAA和2.0 mg/L 6-BA的MS培养基上,其分化率最高可达到42.6%。这些芽在含0.2 mg/L IAA和0.5 mg/L KT的MS培养基上长成2 cm左右的幼苗时,将其切下转至1/2 MS0培养基上,培养10 d即可诱导生根,得到再生植株。随机选取实生苗和下胚轴愈伤组织再生苗进行RAPD分析,结果表明,所用的50个随机引物中有5个扩增出差异性条带,甚至再生植株之间也有1条引物扩增的条带有差异,这说明经组织培养所得到的再生植株与实生苗相比,在DNA水平上发生了一定程度变异,并且这种变异也存在于再生植株之间。     

大赖草的组织培养及植株再生的研究

大刺草在成熟胚在含有２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ的ＭＳ培养上形成颗粒状愈伤组织，减少培养基中的２，４－Ｄ浓度，愈伤组织分化出绿色的芽点。生根培养基为不含任何激素的ＭＳ培养基，有分化能力的愈伤组织可以在保持培养基（ＭＳ＋２ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡＰ）上长期保存，利用这一培养程序可以快速，大量地繁殖大赖草，文章还对外源激素在植物组织培养中的作用进行了讨论。     

结缕草组织培养及农杆菌介导转化的主要因子优化

以破除休眠的结缕草种子为试材,对其愈伤组织的诱导、分化及农杆菌介导法转化的主要因子作了研究.结果表明,结缕草种子愈伤组织的诱导以含2,4-D 1 mg/L NAA 3 mg/L、分化以含6-BA 3 mg/L KT 3.5 mg/L、生根以含NAA 0.3 mg/L的MS培养基为佳.GUS瞬间表达研究表明,以继代培养2周的愈伤组织为起始材料,采用负压处理和农杆菌感染10 min,尔后在光条件下共培养转化为佳.     

草地早熟禾高效丛生芽体系的建立

本试验以草地早熟禾无菌种子苗茎尖为外植体,建立了高效的草地早熟禾丛生芽离体培养体系。结果表明:茎尖在附加0.5mg/L2,4-D和3.0mg/L6-BA的MS培养基上可诱导茎尖部位基部膨大,且诱导率最高。膨大的基部在2.0mg/L6-BA的丛生芽诱导培养基上,其诱导频率最大,然后将丛生芽转入附加3.0mg/L6-BA和0.07mg/L2,4-D的培养基上可进行继代培养,丛生芽在1/2MS培养基上生根率达100%。     

结缕草‘Zenith’离体培养植株再生体系优化研究

以结缕草Zoysia japonica栽培品种‘Zenith’的成熟种子为外植体,通过调整2,4 D浓度和凝固剂种类及其浓度,进行结缕草离体培养植株再生体系优化的研究。结果表明：愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+2,4 D 4.0 mg/L,愈伤组织诱导率为69.97%,其中胚性愈伤组织诱导率达28.78%。胚性愈伤组织包括2种类型：淡黄色、湿润的小颗粒聚集状愈伤组织(27.36%)和黄色、干燥、颗粒状愈伤组织(1.42%)。以结冷胶为凝固剂,有利于提高愈伤组织的诱导率。提高愈伤组织继代培养基中的琼脂浓度,有利于保持胚性愈伤组织的植株再生能力。适宜的愈伤组织分化培养基为MS+KT 4.0 mg/L或MS+6 BA 3.0 mg/L,绿苗分化率达90%以上。适宜的生根培养基为1/2MS ,生根率100%。     

无机盐对甘草愈伤组织生长及总黄酮含量的影响

本研究以甘草无菌苗的下胚轴为供试材料,以MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+agar 8 g/L+sugar 30 g/L为基本培养基,利用组织培养技术并结合紫外分光光度法探究了MS培养基中5种不同无机盐浓度及各种成分之间的交互作用对甘草愈伤组织增长量、生理指标及次生代谢产物的影响。结果表明,适量增加KNO₃和MnSO₄·4H₂O的含量有利于甘草愈伤组织生物量的积累;随着MS培养基中CaCl₂·2H₂O浓度的增加,有利于可溶性糖和总黄酮含量的积累;浓度为2533 mg/L KNO₃最有利于提高POD活性;KH₂PO₄浓度在170~226 mg/L范围内,愈伤组织生长量和总黄酮含量显著提高;MS培养基中MgSO₄·7H₂O有利于甘草愈伤组织的生长及总黄酮的合成。而愈伤组织的生长状况与总黄酮的合成是多种无机盐离子之间交互作用的结果,通过正交试验及极差分析得出最优营养元素组合为MgSO₄·7H₂O 493 mg/L+MnSO₄·4H₂O 7 mg/L+KNO₃ 2533 mg/L+KH₂PO₄ 170 mg/L+CaCl₂·2H₂O 733 mg/L。