牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体(prolactin releasing hormone receptor,PRLHR)基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5′-UTR 22 bp和3′-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05);在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛(P0.01)。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

多浪羊CNP基因克隆及其在初情期组织表达特性分析

【目的】 克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】 参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】 多浪羊CNP基因序列大小为2 227 bp,其中包括5'-UTR 50 bp、3'-UTR 914 bp和CDS区1 263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】 本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。     

牦牛StAR基因克隆及其生物信息学与组织表达特性的研究

旨在克隆获得牦牛StAR基因编码序列（CDS）并进行生物信息学分析,探究其mRNA组织表达特性。本研究以屠宰场采集的成年母牦牛心、肝、脾、肺、肾、卵巢、输卵管、子宫组织（n=5）,不同年龄（胎牛、1岁、2岁）牦牛的卵巢（n=3）,不同发情周期（卵泡期、黄体期）的牦牛卵巢（n=3）,黄体期黄牛的卵巢（n=3）及实验室冻存的牦牛颗粒细胞为研究材料。以牦牛黄体期卵巢cDNA为模板,用逆转录PCR克隆StAR基因,并使用MEGA7.0和ExPASy-ProtParam等软件分析其生物信息学特性;采用实时荧光定量PCR技术分析牦牛StAR基因组织表达特性。结果发现,StAR基因CDS区长858 bp,编码285个氨基酸,StAR蛋白总体带正电荷,属于碱性亲水稳定蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要存在于细胞质和线粒体; StAR基因具有较高的保守性,符合物种进化规律。牦牛StAR基因在卵巢表达水平最高（P<0.01）,且2岁时卵巢表达水平极显著高于胎牛和1岁龄（P<0.01）,黄体期卵巢表达水平极显著高于卵泡期（P<0.01）;黄体期黄牛卵巢中StAR基因的表达量极显著高于牦牛（P<0.01）;在颗粒细胞的体外培养过程中StAR基因表达量逐渐上升,在培养24 h时达到高峰（P<0.01）,随后显著降低。综上所述,StAR基因序列较为保守,在牦牛卵巢组织中表达最高,且表达水平随年龄与卵巢周期而变化,提示StAR基因可能参与牦牛卵巢及黄体功能相关的繁殖调控。     

延边黄牛DGATs基因克隆、生物信息学及组织表达分析

试验旨在克隆延边黄牛二酯酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGATs）两种亚型（DGAT1和DGAT2）的CDS区核苷酸序列，并根据生物信息学对两种亚型的氨基酸序列进行分析，以及探讨其在延边黄牛各组织中的表达规律。采用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分别进行DGATs基因CDS区的扩增、克隆以及其在延边黄牛8个组织中mRNA表达量的检测，利用NCBI中BLAST将其与其他物种进行相似性分析，并构建系统进化树；通过在线工具对其编码蛋白的理化性质、一级结构及高级结构进行预测。结果显示，DGAT1和DGAT2基因CDS区序列长度分别为1 470和1 086 bp，分别编码489和361个氨基酸；二者均为稳定的疏水性蛋白。DGAT1存在25个潜在的磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个跨膜结构域；DGAT2存在28个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和1个跨膜结构域。二者均不存在信号肽，即不属于分泌蛋白。DGAT1主要是通过α-螺旋和无规则卷曲连接，而DGAT2以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链连接为主。延边黄牛DGAT1和DGAT2基因分别在延边黄牛小肠和脂肪组织中表达量最高，且显著高于其他组织（P<0.05）。本试验结果对进一步研究延边黄牛DGATs基因以及探究其在脂肪沉积过程中的作用机制具有重要意义。     

牦牛跨膜附睾蛋白1基因的克隆及其在卵丘卵母细胞复合体中的表达分析

试验旨在分析牦牛跨膜附睾蛋白1（transmembrane epididymal protein 1，TEDDM1）基因的分子特征及其在卵泡发育中的时序表达特性。研究分别收集发情期牦牛大卵泡（φ≥8 mm）、中卵泡（φ=5~7 mm）和小卵泡（φ≤3 mm）中的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）；提取总RNA并反转录，对TEDDM1基因CDS区全序列进行克隆测序，用生物信息学软件分析其编码蛋白分子特征；以牛GAPDH基因为内参，采用实时荧光定量PCR技术分析TEDDM1基因在卵泡发育不同时期的表达水平。结果表明，牦牛TEDDM1基因CDS区全长903 bp，共编码300个氨基酸，与野牦牛、牛、野牛、绵羊和水牛氨基酸序列有极高的相似性，在进化中较为保守；牦牛TEDDM1蛋白为非分泌型不稳定疏水蛋白，共存在7个螺旋结构，整条肽链7次横跨胞膜，属于典型的G蛋白偶联受体；其潜在的磷酸化位点共21个，其中酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸磷酸化位点分别为1、3和17个，仅存在1个N-糖基化位点，无O-糖基化位点；存在未知功能结构域蛋白家族（domains of unknow function protein families，DUFs）716结构域，且该结构域涵盖多个跨膜区域；实时荧光定量PCR检测结果发现，中卵泡中TEDDM1基因表达水平显著高于大卵泡和小卵泡（P<0.05），而大卵泡与小卵泡的表达水平差异不显著（P>0.05）。本研究分析了牦牛TEDDM1基因序列及其在牦牛COCs中的表达特性，为进一步揭示该基因在牦牛卵泡发育过程中的调控作用奠定了理论基础。     

延边牛PPARγ基因的克隆及生物信息学分析

研究旨在克隆和分析延边牛过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因,并探讨其在延边牛不同组织中的表达规律。参考GenBank数据库中牛PPARγ的序列（登录号：NM_181024.2）设计引物,以18月龄延边牛为试验对象,利用RT-PCR克隆得到延边牛PPARγ基因,利用NCBI中的BLAST程序与其他物种进行相似性分析并构建系统进化树;用生物信息学软件分析其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构等;用实时荧光定量PCR检测延边牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、皮下脂肪、肌肉8个组织中PPARγ基因的相对表达水平。结果显示,延边牛PPARγ基因CDS区序列为1 620 bp,相似性比对和系统进化树结果显示,与黄牛的亲缘关系最近,相似性为99.9%,与鸡的亲缘关系最远,相似性为82.1%;该基因编码505个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,为亲水性蛋白,主要分布在细胞核和细胞质中;延边牛PPARγ蛋白二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,存在53个潜在的磷酸化位点,24个O-糖基化位点;实时荧光定量PCR结果显示,延边牛PPARγ基因在脾脏、皮下脂肪、肝脏中表达量显著高于心脏（P<0.05）,肺脏、肾脏、肌肉和小肠中表达量显著低于心脏（P<0.05）。以上试验结果可为进一步研究PPARγ基因的功能提供借鉴。     

青海高原牦牛PRDM16基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

本研究对青海高原牦牛PRDM16 (PR domain containing 16)基因部分编码区进行克隆及生物信息学分析,同时对PRDM16基因在雌、雄牦牛背最长肌肌肉组织中的表达差异进行了分析.选取雌、雄青海高原牦牛各5头,屠宰后采集背最长肌肌肉组织,克隆牦牛PRDM16基因部分CDS区序列,分析其生物信息学特征;应用实时荧光定量PCR技术检测PRDM16基因在雌、雄牦牛肌肉组织中表达水平.结果显示:克隆所得片段序列长323 bp,与黄牛同源性为100%,编码99个氨基酸,具有MDS1-EVI1(complex locus protein MDS1)家族蛋白功能,具有CATH蛋白功能活性,包含卷曲螺旋等典型结构域,与人甲基转移酶蛋白结构域PR蛋白1有20%的相似性;PRDM16基因在雌性牦牛肌肉组织中表达水平极显著高于雄性牦牛(P<0.01).本试验结果为进步一研究青海高原牦牛PRDM16基因奠定了基础,为牦牛肉品质分析提供参考.     

牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的克隆及其在各组织和不同生长阶段肝中的差异表达分析

旨在克隆牦牛胰岛素样生长因子结合蛋白4和5（insulin-like growth factor binding protein 4 and 5,IGFBP4 and IGFBP5）基因,并检测其在牦牛不同组织及不同生长阶段肝中的表达水平。本研究选取1日龄、15月龄和5岁龄健康雌性麦洼牦牛共9头（每组各3头）,体重分别约为（12.35±1.85）、（98.88±2.50）和（268.55±27.82） kg,采集5岁龄牦牛心、肝、脾、肺、肾、小肠组织及3个不同生长阶段牦牛肝组织。本试验克隆IGFBP4和IGFBP5基因,并对其序列进行生物信息学分析,采用qRT-PCR方法、Western blot技术与免疫组化技术检测其在5岁龄牦牛6种组织及1日龄、15月龄和5岁龄3个不同生长阶段肝中的表达差异。结果表明,获得牦牛IGFBP4和IGFBP5基因的CDS序列分别为777和816 bp,分别编码258和271个氨基酸,GenBank序列号分别为MT012934和MT003005。在同源性比较中,牦牛IGFBP4和IGFBP5序列均与黄牛的同源性最高,分别为99.6%、99.5%。组织表达谱分析显示,IGFBP4和IGFBP5基因均在5岁龄牦牛肝中表达量最高,与肾、心、小肠、脾、肺相比差异极显著（P<0.01）,且6种组织中IGFBP4基因的表达量均极显著高于IGFBP5基因（P<0.01）。不同生长阶段肝中差异表达结果显示,随着年龄的增长,IGFBP4和IGFBP5的mRNA与蛋白水平在牦牛肝脏组织中的表达量均呈现上升趋势,即5岁龄>15月龄>1日龄,在5岁龄时表达量最高,与1日龄和15月龄均存在极显著差异（P<0.01）,且IGFBP4的表达量极显著高于IGFBP5（P<0.01）。结果提示,IGFBP4和IGFBP5可能协同调控牦牛肝的生长发育,这为深入研究IGFBP4和IGFBP5在牦牛肝生长发育过程中的作用以及表达调控提供了一定的基础数据。     

牦牛NGF基因克隆及其在生殖器官中的表达定位

旨在探究NGF基因的生物学特性及其在母牦牛生殖器官中的表达特性.本研究收集黄体期母牦牛的心、肝、脾、肺、肾以及胎牛期、卵泡期、黄体期、妊娠期母牦牛的卵巢、子宫和输卵管(n=3),利用RT-PCR克隆牦牛NGF基因,并对其序列进行生物信息学分析,利用RT-qPCR技术分析NGF基因的组织表达特性,利用免疫组化技术(IHC...     

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

Cloning,Bioinformatics and Tissue Differential Expression Analysis of PRDM16 Gene in Qinghai Plateau Yak

In this study,the part coding region of PRDM16 gene of the Qinghai plateau yak was cloned and its bioinformatics and differential expression of PRDM16 gene of muscle tissue were analyzed in different sex individual.The PRDM16 gene part of CDS region was cloned from the longissimus dorsi muscle tissue of Qinghai plateau yak,analyzed its characteristics of bioinformatics and detected gene expression levels of different sex individuals in muscle tissue by Real-time PCR.The results showed that the sequence length of the cloned fragment was 323 bp,the homology between Qinghai plateau yak and cattle was 100%.It encoded 99 amino acids,containing domains of MDS1-EVI1 (complex locus protein MDS1) family proteins function,CATH protein function and typical structure of the curly spiral.PRDM16 protein was 20% of the similarity with people methyltransferase protein domain PR protein 1.PRDM16 gene expression of female yak was significantly higher than male yak's in longissimus dorsi muscle tissue (P<0.01).The test results provided not only research foundation for genetic progress but also technical references for yak meat quality analysis.