小鼠卵巢组织定量PCR分析中内参基因的筛选

旨在选择小鼠卵巢组织中合适的内参基因,为研究卵巢发育过程中基因表达提供可靠数据。以不同年龄(0日龄、3周龄、5周龄、8周龄)小鼠卵巢组织为试验材料,Trizol法提取样本总RNA,并合成cDNA,根据已报道的小鼠(Mus musculus)各组织中相对稳定表达的8个常见内参基因(Gapdh、β-actin、β-tubulin、18S rRNA、16S rRNA、H2afz、Ubc、Rpl13a)的GenBank登录序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法构建卵巢cDNA等梯度(1∶10)稀释后的标准曲线;利用geNorm分析候选内参基因的表达稳定性(M);NormFinder筛选表达最稳定的内参基因;BestKeeper计算qRT-PCR结果的标准差(SD)和变异系数(CV),从而预测候选内参基因的稳定性。结果表明,8个内参基因的引物特异性较强,具有良好的线性关系;候选内参基因的表达稳定度排序:Gapdh=β-actin>18S rRNA>Ubc>16S rRNA> H2afz>Rpl13a>β-tubulin;其中Gapdh表达稳定性最好,且标准差及方差系数最小(SD:0.32,CV:1.95),H2afz标准差及方差系数最大(SD>1.0,CV:5.76)。综上表明,本研究成功获得出生后小鼠卵巢发育过程中稳定表达的内参基因(Gapdh和β-actin),可作为其基因表达研究中的最佳候选内参。     

氯化钴诱导HepG2细胞低氧应激模型的建立

探索氯化钴(CoCl_2)诱导人肝癌细胞系HepG2建立低氧应激模型的条件,并评价该模型。不同浓度氯化钴处理HepG2细胞后,PCR法检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、激活转录因子4(ATF4)、腺苷酸激酶4(AK4)基因的表达;细胞计数法绘制对照组细胞和氯化钴处理组细胞的增殖曲线。随着CoCl_2浓度升高和处理时间的延长,HIF-1αm RNA和ATF4 m RNA表达显著升高、AK4 m RNA表达显著下降、HepG2细胞增殖速度显著下降(P0.05)、细胞膜不完整边界不清。氯化钴化学模拟低氧过程中影响了缺氧主要调节因子HIF-1α的水平,因此以氯化钴用于构建模拟HepG2细胞缺氧诱导模型是可行的,ATF4和AK4可能在参与HepG2细胞抗低氧应激反应中起关键作用。此模型的建立为进一步研究AK4基因的生理学功能奠定了基础。     

KDM2B在小鼠卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达分析

本研究旨在分析KDM2B在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达规律,为KDM2B在卵母细胞减数分裂及胚胎发育过程中的生物学作用奠定基础。选择20只6～8周龄小鼠为试验动物,收集GV期、MⅡ期卵母细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞、囊胚各阶段胚胎,根据GenBank上已公布的小鼠(Mus musculus)KDM2B序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测KDM2B在胚胎各阶段mRNA的表达水平;通过免疫荧光染色定位KDM2B蛋白在胚胎各阶段的分布。结果显示,GV期卵母细胞KDM2B mRNA的表达量极显著高于MⅡ期(P<0.01);在2-细胞、4-细胞和8-细胞mRNA表达量较低,囊胚期其表达量极显著升高(P<0.01);卵母细胞成熟过程中,KDM2B在GV期主要表达于细胞核中,MⅡ期卵母细胞核中的荧光信号极显著减弱(P<0.01),早期胚胎发育过程中,KDM2B蛋白在2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎中均不表达,囊胚期重新表达于细胞核。综上表明,本研究成功建立KDM2B在小鼠卵母细胞及胚胎细胞中的时空及时序表达模式,关于KDM2B参与调控减数分裂与胚胎发育过程具体的作用机制有待进一步研究。     

牦牛HDAC1基因克隆及其在组织和卵母细胞减数分裂过程中的表达研究

旨在克隆牦牛组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases 1,HDAC1)基因,并检测其在牦牛不同组织及卵母细胞减数分裂过程中的表达水平,从而为研究HDAC1在牦牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。本试验采用牦牛为研究对象,通过RT-PCR技术获得牦牛HDAC1基因CDS序列,使用相关生物信息学软件分析其结构和功能,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测HDAC1基因在牦牛脑、心、肌肉、卵巢、肾、脾、小肠、肝、肺和子宫组织中的表达谱及在卵母细胞减数分裂过程中mRNA的表达水平。结果表明,HDAC1基因开放阅读框为1 302 bp,编码433个氨基酸,与黄牛、山羊和绵羊的同源性较高;HDAC1基因在牦牛的各个组织中均有表达,其中在脾、肾和小肠中的表达量极显著高于其他组织(P0.01)。在牦牛减数第一次分裂中期(MⅠ)和减数第二次分裂中期(MⅡ)卵母细胞中,HDAC1基因的表达水平极显著高于生发泡(germinal vesicle,GV)期(P0.01)。提示,HDAC1基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程。本试验为进一步研究HDAC1基因在高寒、低氧环境下的牦牛生殖繁育中的作用提供了理论依据。     

三江牛资源保护利用现状与展望

通过产区走访调研和查阅文献等方式收集资料,研究梳理了三江牛遗传资源保护利用现状,分析了三江牛品种特征特性,剖析了三江牛产业发展问题,并提出了种质资源保护和产业发展建议。     

SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。