鲤疱疹病毒2型微滴式数字PCR检测方法的建立及比较分析

本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析.结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍.在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR (R2=0.994)和qPCR (R2=0.994)均表现出良好的线性关系,且2种检测方法间的定量值呈正相关(R2=0.989).在定量检测相同稀释度的CyHV-2 DNA时,qPCR的定量值始终比ddPCR高10倍.ddPCR的组内和组间重复变异系数(CV)分别为0.59％-11.26％和6.55％-23.21％,而qPCR为16.57％-27.56％和22.31％-56.73％,说明ddPCR具有更好的稳定性.在临床样品定量检测时,ddPCR的检出率稍高于qPCR.本研究建立的ddPCR能够准确定量检测CyHV-2,将为CyHV-2相关研究提供有益参考.     

鲑鱼甲病毒病研究进展

1疾病概述
　　冷水鲑科鱼类价格昂贵,是世界三大养殖鱼类之一,主要分布于欧洲和北美。目前我国的鲑科鱼养殖以虹鳟（Oncorhynchus mykiss）为主,年产量占世界总产量的1％以下,每年需要进口大量的鲑鱼,尤其是大西洋鲑鱼（Salmo salar ）［1-2］,鲑鱼甲病毒病对于我国的鲑科鱼养殖具有潜在的威胁。     

山羊痘病毒非必需基因区gp024基因的鉴定

为筛选山羊痘病毒(GTPV)的外源基因插入区,本研究以GTPV Pellor株为模板,设计2对引物,PCR扩增AV 41株GTPV_gp024基因相邻上下游长度约1.1 kb的同源重组片段,分别插入质粒pGPT-EGFP中.插入部位在痘病毒双向启动子p11～p7.5启动的报告基因EGFP-GPT上下游,构建转移载体pEG024,并转染已感染GTPV Av 41病毒的LT细胞,经GPT加压筛选7代后得到重组病毒.结果显示,重组病毒稳定表达报告基因EGFP,从而表明GTPV_gp024基因能够作为外源基因的插入区.     

表达牛冠状病毒S1基因的重组人腺病毒的构建及鉴定

为构建表达牛冠状病毒(BCV)S1基因的重组人腺病毒疫苗,本实验通过人工合成密码子优化的截短BCV S1的基因片段(55 bp～1 650 bp)。将其克隆到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,并以PmeⅠ线性化后转化含有人5型腺病毒骨架的BJ5183感受态细胞,通过细菌内同源重组的方式获得重组腺病毒质粒pAdV-BCV-S1,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞获得重组腺病毒rAdV-BCV-S1。利用间接免疫荧光法和western blot法检测该重组腺病毒的S1基因在AD-293细胞中的表达情况,同时用一步生长曲线法,测定该重组腺病毒的复制能力。结果表明:BCV S1基因在感染细胞中获得了高效表达:子代重组腺病毒在感染细胞后60 h滴度最高,为6.8×108 pfu/mL。该重组腺病毒的构建为BCV重组疫苗的研究奠定了基础。     

亚洲1型口蹄疫病毒L蛋白缺失株的构建及其生物学定性

为确定口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白缺失对其生物学特性的影响,本研究在已建立的Asia1型FMDV反向遗传操作平台基础上,利用融合PCR方法缺失L蛋白基因编码区,构建了缺失L蛋白的重组Asia1型FMDV(rFMDV-ΔL)。拯救病毒的一步生长曲线结果表明,rFMDV-ΔL与亲本病毒相比在BHK-21细胞中的复制水平下降10倍,乳鼠毒力试验表明rFMDV-ΔL的毒力比亲本毒株下降6倍。另外,rFMDV-ΔL在BHK-21细胞上产生病变的速度明显变慢,形成蚀斑的时间延长,致乳鼠死亡所需时间也比亲本毒株明显延长。本研究是关于亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能研究的首次报道,为亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

优质芹菜新品种‘申芹2号’

‘申芹2号’芹菜是从‘荷兰红芹’和‘黄心芹’杂交后代中经多代分离纯化,选育而成的优质新品种。植株直立,株高55 ~ 60 cm。外叶黄绿色,心叶嫩黄色,叶柄黄绿带红,叶柄长35.6 cm,叶柄宽0.85 cm,叶柄基部宽1.15 cm。质地脆嫩,味清香,富含铁元素和芹菜素,纤维素含量低。生长速度快,定植后50 d开始收获,单株质量266 g,平均产量43 t · hm^-2。耐热性好,适宜长江中下游地区保护地和露地栽培。     

口蹄疫病毒vp3-间接免疫荧光诊断方法的建立

口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP3为保守区,各血清型间差异不大,因此以其为抗原建立一种快速、有效、操作简便的FMDV自然感染动物与疫苗免疫动物鉴别诊断方法.PCR扩增口蹄疫病毒结构蛋白VP3基因,克隆到杆状病毒表达系统转移载体pFastBacHT-A中,转座DH10感受态细胞,获得阳性克隆.提取基因组Bacmid,转染Sf9昆虫细胞,获得含口蹄疫病毒结构蛋白基因VP3基因的重组杆状病毒.以被检测血清为一抗,以FITC标记的兔抗牛IGg为二抗,通过反应条件的优化,建立间接免疫荧光检测方法,并检测血清44份,与EIASA方法符合率为90.9%.     

牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ.参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因.选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析.结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460 bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%.由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道.     

禽流感病毒荧光免疫层析检测试纸条的研制

禽流感是重要的人兽共患病,建立现场快速灵敏的检测方法是防控其发生和流行的前提和基础。本研究采用不同亚型流感毒株交叉免疫小鼠法来免疫小鼠,通过多个亚型的NP表达蛋白来筛选杂交瘤阳性细胞株,获得分泌针对NP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞4株。通过抗体的两两配对,基于荧光量子点作为免疫层析抗体的标记探针,借助免疫层析试纸条双抗夹心法原理,筛选出了适用于免疫层析的两株单克隆抗体,研制了禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV )荧光免疫层析检测试纸条[A lateral-flow immunoassay strip with quantum dots(QDs)against AIV , AIV -QD-LFIA],并对该试纸条进行了特异性、敏感性、可重复性及可靠性分析。试验结果显示:本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条检测禽流感标准抗原H5N1-HK的敏感性达到104 EID50 ,检测标准抗原H9N2-HK的灵敏度为102 EID50 ,比商品化的禽流感病毒抗原检测卡灵敏度高100倍,比国家标准实时荧光RT-PCR(rRT-PCR)灵敏度低约100倍;可特异性地检测出H5亚型、H7亚型、H9亚型、H1亚型、H3亚型等A型流感病毒,与 IBV 、 NDV 等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应,且经过了国家流感中心标准样本盘的样品测试,特异性强;同时该法具有良好重复性,连续4周检测20个样品重复结果均为阳性;小规模田间试验显示该法用于禽流感病毒的普查监测结果可靠。可见本研究所建立的 AIV -QD-LFIA试纸条可满足禽流感病毒快速、高灵敏的检测需求,具有广阔的应用空间。     

困惑与选择:少数民族传统体育价值取向的理性思考——以新疆南疆为例

随着新疆南疆社会经济的快速发展式,少数民族传统体育的价值取向出现了多元化的发展趋势,但因多方因素的影响,其发展过程中也出现了许多困惑。通过运用文献资料法、田野调查法、问卷调查法、专家访谈法对新疆南疆少数民族传统体育发展过程中出现的种种现象进行细致的梳理,并进一步的对新疆南疆少数民族传统体育的价值取向进行分析和解读,对引导新疆南疆少数民族传统体育价值取向的正确定位具有现实意义。