Asia1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组.待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析.结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个.感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个.结果表明FMDV感染BHK-21细胞后弓l起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果.本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制.     

Asia1型口蹄疫病毒前导蛋白(Lpro)亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)前导蛋白(Lpro)亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L.利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting.方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶(PI)染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位.结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDVL基因在BHK-21细胞中得到表达;western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布.     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

脑心肌炎病毒IRES置换不影响口蹄疫病毒的复制和毒力

内部核糖体进入位点(IRES)是微RNA病毒起始蛋白合成的关键元件。为研究IRES元件在病毒致病过程中的作用,本研究以口蹄疫病毒(FMDV)为模型,在已建立的O型FMDV c DNA感染性克隆的基础上,利用融合PCR的方法以脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES替换FMDV的IRES,构建并拯救出含有EMCV IRES的嵌合病毒(r FMDV-EIRES)。一步生长曲线结果显示r FMDV-EIRES无论是在鼠源BHK-21细胞还是在猪源IBRS-2细胞中的复制能力均与亲本病毒相近。另外,r FMDV-EIRES对乳鼠的致病力与亲本病毒也相同。以上研究结果表明,虽然EMCV IRES与FMDV IRES一级序列存在显著差异,但二者的置换并不影响FMDV的复制和毒力,该结果有助于加深IRES在微RNA病毒复制和致病性功能的认识。     

Asia1型口蹄疫病毒含RSD受体识别位点感染性克隆的构建与病毒拯救

口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)具有高的突变率和很强的适应性,在环境条件变化时会迅速从准种种群中选择变异株来适应新的环境,这些变异株包括在RGD受体结合基序内部或附近氨基酸的替换。FMDV Asia1/JS/China/05株经不同宿主传代后产生含RSD和RDD受体识别基序的变异株,为了研究含RDD受体识别基序的FMDV在受体结合位点内1个氨基酸的变化是否影响感染性病毒子的产生,作者利用已构建的含RDD受体结合位点的FMDV Asia1/JS/China/05株的全长感染性cDNA克隆为骨架,采用融合PCR方法,构建了该毒株含RSD受体位点的全长cDNA克隆pFMDV-RSD。线性化的pFMDV-RSD重组质粒和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,56 h后可观察到典型的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别进行序列测定、间接免疫荧光试验、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析,结果证实该毒株细胞受体位点1个氨基酸的替换不影响活病毒的拯救。该试验为进一步研究含RSD受体结合位点FMDV的生物学特性奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒前导蛋白（L^pro）亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白（Lpro）亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L。利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶（PI）染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位。结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDV L基因在BHK-21细胞中得到表达;Western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布。     

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。     

口蹄疫病毒VP2基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD...     

牛干扰素诱导跨膜蛋白3对口蹄疫病毒感染的抑制作用

为了研究牛干扰素诱导跨膜蛋白3(bIFITM3)对O型口蹄疫病毒(FMDV)的抑制作用,本试验将表达bIFITM3的重组质粒pLV-bIFITM3和表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的对照质粒pLV-EGFP分别转染BHK-21细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得能够稳定表达外源基因的细胞系。用O型FMDV感染稳定细胞系,通过观察细胞病变、噬斑分析和实时荧光定量PCR方法评价bIFITM3对O型FMDV感染的抑制作用。结果表明,成功筛选获得稳定表达bIFITM3与EGFP的BHK-21细胞系,bIFITM3表达后显著抑制FMDV感染BHK-21细胞,且抑制作用在病毒感染循环的早期阶段就已显现。本试验证明bIFITM3在FMDV感染中具有抗病毒作用,为口蹄疫的防控研究提供新的思路和理论依据。     

O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-OY/S/CHA/05.将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE).同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE.对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3 510位人工消除了Xba Ⅰ酶切位点.免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV.病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性.本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

用纯化的Asia1型口蹄疫病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H6、5G3,其细胞培养上清效价分别为1:64和1:128,小鼠腹水效价分别为1×10~(-4)和8×10~(-3);ELISA和IFA结果显示,2株单抗仅与Asial型口蹄疫病毒反应,不与O型口蹄疫病毒反应,表明它们均为抗Asial型口蹄疫病毒的型特异性单克隆抗体。westem blot结果显示,2株单克隆抗体均不与全病毒抗原反应,表明它们所针对的抗原表位均为构象表位。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经硫氰酸盐洗脱法测定,3H6和5G3的相对亲和力指数分别为1.0 mol/L和1.5 mol/L。这2株单抗的获得为建立口蹄疫病毒检测方法提供了强有力的工具。     

口蹄疫病毒诱导BHK-21细胞产生凋亡的研究

试验利用口蹄疫病毒感染BHK-21细胞,通过MTT法、Hoechst 33258染色、原位末端标记技术(TUNEL)、流式细胞术和链特异性荧光定量RT-PCR,分别就口蹄疫病毒对BHK-21细胞生长的抑制作用、凋亡细胞的形态学和分子生物学特征、凋亡峰的出现和细胞周期的变化以及口蹄疫病毒基因组在BHK-21细胞内的复制情况进行了检测。结果表明:口蹄疫病毒可抑制BHK-21细胞的生长并诱导其产生凋亡,呈现典型的凋亡细胞特征,出现细胞凋亡峰并且细胞周期明显被阻滞在G1/G0期,同时对凋亡率和口蹄疫病毒基因组复制的关系做了初步研究。     

共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定

为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。     

金丝桃素体外抗口蹄疫病毒与宿主细胞吸附作用研究

对光活化金丝桃素体外抑制口蹄疫病毒与宿主细胞吸附作用进行实验。体外培养的BHK-21细胞加入金丝桃素,日光灯下光活化1h后感染FMDV。通过细胞病变观察、MTT法、双抗体捕获抗原法、扫描电子显微镜进行抑制FMDV与宿主细胞吸附、融合研究。结果表明金丝桃素有明显抑制细胞病变的作用。双抗体捕获抗原法检测金丝桃素有效抑制FMDV和BHK-21细胞的吸附、融合,抑制率可达59．72％。扫描电镜观察,金丝桃素组与病毒对照组相比,BHK-21细胞FMDV颗粒明显减少。提示金丝桃素在体外有显著抑制口蹄疫病毒与宿主细胞的吸附、融合作用。     

Construction of a multiple targeting RNAi plasmid that inhibits target gene expression and FMDV replication in BHK-21 cells and suckling mice

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious disease that afflicts cloven-hoofed animals. The etiological agent of FMD is foot-and-mouth disease virus (FMDV). The VP1 gene of FMDV is essential during the life cycle of the virus and plays a key role in the attachment of the virus to susceptible cells. We constructed a plasmid, pCWN11, that expresses siRNAs multiple-targeting the VP1 genes of FMDV. We evaluated the gene silencing efficiency of the plasmid using an enhanced green fluorescent protein (EGFP) reporter system in BHK-21 cells. The antiviral potential of the plasmid in BHK-21 cells and suckling mice were investigated. The results indicate that cotransfection of pCWN11 with any one of three serotypes VP1-EGFP plasmids resulted in a reduction in the EGFP signal relative to the control. Moreover, the antiviral potential induced by pCWN11 was evident during challenge with one FMDV isolate of either serotype O (HKN/2002) or serotype Asia I (YNBS/58), and the inhibition extended to almost 40 h. Furthermore, subcutaneous injection of pCWN11 in the neck made suckling mice significantly less susceptible to FMDV serotype O and Asia I.     

稳定表达TIGAR基因的BHK-21细胞系的构建及其对新城疫病毒增殖效果的评价

TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子（TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR）是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒（NDV）引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠TIGAR基因和鸡TIGAR基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的TIGAR基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达TIGAR细胞系（BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR）。使用Western blot、DNA测序和qPCR对TIGAR基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示：重组细胞系BHK-21-chTIGAR细胞和BHK-21-hamTIGAR细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,TIGAR基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,TIGAR基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示：BHK-21-hamTIGAR细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chTIGAR细胞;病毒生长曲线结果显示：强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（5.67,72 h）高于BHK-21-chTIGAR细胞（5.53,72 h）和野生型BHK-21细胞（5.27,72 h）;中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（4.90,96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（4.57,96 h）和野生型BHK-21细胞（4.67,96 h）;弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamTIGAR细胞后的TCID₅₀（4.07,96 h）要高于BHK-21-chTIGAR细胞（3.90,96 h）和野生型BHK-21细胞（3.77,96 h）。综上所述,所构建的BHK-21-hamTIGAR细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。     

Attenuated Salmonella choleraesuis-mediated RNAi targeted to conserved regions against foot-and-mouth disease virus in guinea pigs and swine

In this study, specific sequences within three genes (3D, VP4 and 2B) of the foot-and-mouth disease virus (FMDV) genome were determined to be effective RNAi targets. These sequences are highly conserved among different serotype viruses based on sequence analysis. Small interfering RNA (siRNA)-expressing plasmids (p3D-NT19, p3D-NT56, pVP4-NT19, pVP4-NT65 and p2B-NT25) were constructed to express siRNA targeting 3D, VP4 and 2B, respectively. The antiviral potential of these siRNA for various FMDV isolates was investigated in baby hamster kidney (BHK-21) cells and suckling mice. The results show that these siRNA inhibited virus yield 10- to 300-fold for different FMDV isolates of serotype O and serotype Asia I at 48 h post infection in BHK-21 cells compared to control cells. In suckling mice, p3D-NT56 and p2B-NT25 delayed the death of mice. Twenty percent to 40% of the animals that received a single siRNA dose survived 5 days post infection with serotype O or serotype Asia I. We used an attenuated Salmonella choleraesuis (C500) vaccine strain, to carry the plasmid that expresses siRNA directed against the polymerase gene 3D (p3D-NT56) of FMDV. We used guinea pigs to evaluate the inhibitory effects of recombinant S. cho (p3D-NT56/S. cho) on FMDV infection. The results show that 80% of guinea pigs inoculated with 10⁹ CFU of p3D-NT56/S. cho and challenged 36 h later with 50 ID₅₀ of homologous FMDV were protected. We also measured the antiviral activity of p3D-NT56/S. cho in swine. The results indicate that 100% of the animals treated with 5 × 10⁹ CFU of p3D-NT56/S. cho were protected in 9 days.     

The plasmid constructs producing shRNA corresponding to the conserved 3D polymerase of Foot and Mouth Disease virus protects guinea pigs against challenge virus

RNA interference (RNAi) has been used as an effective antiviral strategy for its specific silencing of viral gene expression in mammalian cells. In this study, shRNA targeting two regions of Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) i.e. 3D and 5'UTR which are very essential in virus replication were evaluated. The constructs were made using h7K RNA polymerase III promoter. We investigated in vivo inhibitory effect of shRNA on FMDV replication in BHK-21 cells and guinea pigs. The results showed that transfection of 3D shRNA could reduce virus growth by three folds when cells were challenged with 10(2) TCID(50) of FMDV. Pretreated guinea pigs with 3DshRNA were protected 80% with 10(3) GPID(50) of FMDV. As a first report in guinea pigs which are recognized animal model for FMD vaccine potency testing, the study suggests that shRNA could be a viable therapeutic approach to control severity of FMD infection and spread.