稳定表达犬细小病毒VP2结构蛋白的CHO-K1细胞系的建立

为构建犬细小病毒VP2基因分泌性表达细胞系,通过酶切将人CD5信号肽序列从质粒中切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp载体中CD5信号肽的下游,使其与CD5信号肽序列融合,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经脂质体介导转染细胞,后通过G418筛选,建立出稳定表达VP2蛋白的CHO-K1细胞系。测序结果表明,构建的犬细小病毒VP2基因的分泌型表达载体结构正确,表达载体经脂质体介导转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出稳定转染VP2基因的细胞株,经PCR检测证明VP2基因已经整合到细胞的染色体中;经RT-PCR、Westernblot分别检测VP2基因表达的mRNA和VP2蛋白,证明犬细小病毒VP2基因能够在CHO-K1细胞进行稳定性表达。这为下一步研究犬细小病毒VP2蛋白与宿主细胞的相互作用及VP2DNA疫苗奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD...     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒样颗粒编码基因的真核表达载体构建及表达

为了构建O型口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒编码基因的真核表达载体,将FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的基因分别克隆到真核表达载体pVAX1中,再分别通过带有BsmBⅠ、EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,分别对重组质粒pVAX-VP0、pVAX-VP1和pVAX-VP3扩增后进行酶切,用T4连接酶连接得到重组的真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3。对重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3进行PCR鉴定并测序。用脂质体将重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3转染BHK-21细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)及Western blot检测重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3在细胞中的表达情况。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pVAX-VP0VP1VP3,并在BHK-21细胞中得到表达。     

水貂肠炎病毒VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

利用昆虫杆状病毒表达系统表达水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV) VP2 基因,表达的蛋白能够形成病毒样粒子,具有反应原性,为研究MEV新型疫苗奠定基础。采用PCR方法扩增MEV VP2 基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体,目的基因定向克隆到pFast-BacⅠ载体中,构建重组转座载体后转化DH10 Bac感受态细胞,获得重组Bacmid 质粒后转染Sf9昆虫细胞,传毒3代,对表达蛋白进行 Western blotting鉴定。结果成功克隆MEV VP2基因。Western blotting结果证实,表达蛋白能够被MEV单克隆抗体识别。在 Bac-To-Bac 杆状病毒表达系统中成功的表达了MEV VP2蛋白,目的蛋白具有较好的反应原性。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC-2基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光（IFA）、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。     

IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。     

1型鸭肝炎病毒E53株VP1基因在昆虫细胞中的表达及产物分析

根据1型鸭肝炎病毒E53株基因组序列设计并合成一对特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因,将其定向克隆至pFastBacTMHTB载体,转化至DH10BacTM感受态细胞中,蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒rBacmid-VP1,重组质粒在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒。结果表明VP1蛋白在昆虫细胞中获得表达,表达产物能够与兔抗1型鸭肝炎病毒VP1蛋白多抗血清和鸭肝炎病毒阳性血清发生特异性反应。在昆虫细胞中表达VP1蛋白为VP1功能的研究及鸭肝炎病毒抗体的检测提供了物质材料。     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达载体构建

用Trizol提取O型口蹄疫病毒RNA,根据已经公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对VP1基因的引物,通过RT-PCR扩增出VP1基因,将其克隆至表达载体pET-32a中。经测序表明,目的基因VP1已正确地整合至表达质粒中。     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株VP2基因的原核表达、纯化及鉴定

为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达

根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。     

猪瘟病毒Shimen株E2基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

根据已发表的猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）Shimen株的全基因组序列，设计2对引物P1／P2和B1／B2，在B1和B2的5’端分别加上EcoR 1和BamH 1位点，以CSFV—Shimen株脾毒为材料。一步法提取总RNA。并以此为模板采用反转录PCR（RT—PCR）和套式PCR（nPCR）。成功地扩增出约1．2kb的E2基因。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接并转化。经PCR和酶切鉴定获得重组质粒E2-T。将E2-T经EeoR 1和BamH 1酶切消化、回收目的基因后。与经BamH 1／EcoR 1酶切的逆转录病毒载体pBABE—puro连接并转化，经酶切鉴定获得重组质粒pBABE—puro—E2。序列测定表明，目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。