重组牛IFN-α对亚洲Ⅰ型口蹄疫亚单位疫苗免疫小鼠的影响

在大肠杆菌BL21（DE3）中分别表达了牛IFN-α基因、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒（FMDV）VP1和VP1 C末端基因,并纯化了所表达的蛋白.用透析的方法进行蛋白复性后制成油乳剂疫苗,经皮下多点注射免疫小鼠,以MTT法检测小鼠脾淋巴细胞经植物血凝素（PHA）刺激后的增殖反应活性;以液相阻断ELISA检测血清FMDV特异抗体的变化.结果表明,重组VP1（rVP1）和rVP1 C末端蛋白能单独诱发小鼠的体液免疫反应和微量的细胞免疫反应,而与重组牛IFN-α（rBoIFN-α）共同接种的小鼠,体液免疫反应和细胞免疫反应更为明显.     

重组免疫融合肽Tα1-BP5的表达及其免疫佐剂特性研究

胸腺素α1(Tα1)和法氏囊活性五肽(BP5)均具有重要的免疫学功能,但二者在蛋白水平上的联合应用尚未见报道。为探究重组表达融合肽Tα1-BP5(r Tα1-BP5)是否具有免疫佐剂特性,本实验设计合成融合肽Tα1-BP5基因,将其克隆至p ET-32a中进行原核表达,并采用MTT法检测其体外活性。同时以rTα1-BP5联合H9N2型禽流感病毒(AIV)灭活疫苗免疫小鼠,检测免疫后小鼠的HI抗体、IgG抗体亚型和细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平,并通过攻毒试验评价其对小鼠的免疫保护作用。结果显示,rTα1-BP5在大肠杆菌中获得可溶性表达;rTα1-BP5能够增强机体免疫后HI抗体、平衡IgG1和IgG2a抗体、提高Th2型(IFN-γ)和Th1(IL-4)型细胞因子的分泌水平,表明rTα1-BP5能够同时增强机体体液和细胞免疫应答。动物免疫保护试验结果显示rTα1-BP5有助于鼠肺脏中H9N2型AIV的清除。以上结果提示,rTα1-BP5具有良好的免疫佐剂的潜能。本研究为新型疫苗佐剂的研究开发奠定了基础。     

分枝杆菌Hsp70对PCV2 Cap蛋白的免疫佐剂作用研究

为了研究分枝杆菌热休克蛋白(Hsp70)对猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的免疫佐剂作用,以自聚肽ELK16为纯化标签,分别与Hsp70和PCV2 Cap基因融合后诱导表达,利用离心洗涤法进行融合蛋白纯化,获得了纯化的融合蛋白ELK16-Cap、ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70,其纯度高达95%、96%和85%,产量分别为92、84和83 mg/L;接着用PBS、ELK16-Cap、ELK16-Cap+弗氏不完全佐剂(IFA)、ELK16-Cap+ELK16-Hsp70和ELK16-Cap-Hsp70分别免疫小鼠,初免后21 d ELK16-Cap-Hsp70免疫组抗体水平达到最高;在二免后2周取免疫小鼠脾脏淋巴细胞,用试剂盒检测细胞因子表达,TNF-α浓度依次为588.55、802.55、995.55、1 382.55和1 719.55 pg/mL,IFN-γ浓度依次为46.30、92.22、155.56、470.37和518.15 pg/mL,IL-12浓度依次为14.72、28.06、20.83、31.39和34.72 pg/mL。这些研究结果表明,Hsp70对刺激PCV2 Cap蛋白ELISA抗体产生的作用优于IFA,但两者融合蛋白的刺激作用较强;与Cap蛋白融合的Hsp70对刺激TNF-α、IFN-γ和IL-12产生的作用较强,而ELK16-Hsp70+ELK16-Cap对3种细胞因子产生的刺激作用次之。     

沙门氏菌菌蜕佐剂增强结核分枝杆菌4种蛋白的免疫作用研究

探究肠炎沙门氏菌菌蜕(ghost)佐剂对结核分枝杆菌(MTB)4种抗原的免疫增强作用,本研究以MTB中的Rv3802、Rv0394c(SEC)、Rv0199及E6c10(ESAT6与CFP10融合蛋白)蛋白为免疫原,应用小鼠模型评价沙门氏菌菌蜕对MTB4种抗原的免疫佐剂效应。结果显示,蛋白加菌蜕佐剂组可以刺激小鼠产生持久高水平的抗体,并且菌蜕佐剂的免疫增强效果高于弗氏不完全佐剂;IgG1/IgG2a的比率增高,提示蛋白加菌蜕佐剂组小鼠趋向于Th2型免疫反应,同时可以诱导淋巴细胞分化为CD4+T细胞亚群并产生IFN-γ及IL-4细胞因子;病理组织学显示以菌蜕佐剂配伍蛋白制备的亚单位疫苗具有良好的安全性。本研究为结核病的预防和新型疫苗的研发奠定了一定的基础。     

新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白免疫小鼠诱导的免疫应答

为了研究新孢子虫NcSRS2和NcSAG1重组蛋白对动物的免疫效果,利用重组表达的NcSRS2和NcSAG1蛋白与弗氏佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,检测小鼠抗新孢子虫抗体水平和血清中IL-4和IFN-γ含量。结果表明,免疫后的BALB/c小鼠IgG、IgG2a和IFN-γ抗体表达水平升高,IgG1抗体和IL-4表达水平也升高,表明NcSRS2和NcSAG1重组蛋白可激发机体产生Th1型和Th2型免疫反应,且NcSRS2重组蛋白的免疫增强效果与NcSAG1重组蛋白免疫组的差异具有显著统计学意义(P0.05)。本研究结果为研制高效安全的抗新孢子虫的新型疫苗提供了参考。     

布鲁菌外膜蛋白的糖基化及免疫效果检测

为研制安全、有效、新型靶向化布鲁菌外膜蛋白疫苗,采用去污剂连续抽提与电洗脱法分离纯化出布鲁菌外膜蛋白,并进行α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯糖基修饰、佐剂乳化.依据统计学中完全随机实验设计试验,免疫BALB/c小鼠,收集不同时间点血液样品,ELISA法检测血清中IgG和IFN-γ含量.结果显示分离纯化出37.5 kD与47.2 kD的目的蛋白并成功糖基化修饰;纳米颗粒佐剂乳化后的试验用疫苗免疫小鼠,血清IFN-γ水平呈显著升高趋势(P＜0.05);抗体水平略显优势,但差异不显著(P＞0.05).表明试验用疫苗能激发机体的细胞免疫应答,且产生了免疫记忆.本研究为研制布鲁菌新型靶向化疫苗的研发和推广提供了研究依据.     

猪前胸腺肽α在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

为原核表达具有生物活性的重组前胸腺肽α(proTα),本实验利用人工合成的330 bp proTα DNA编码序列,构建重组表达质粒pET-proTα,将其转化于大肠杆菌Rosetta进行诱导表达,采用MTT方法测定重组蛋白对小鼠脾细胞和胸腺细胞增殖的影响。SDS-PAGE结果显示proTα重组蛋白以可溶形式表达,分子量约32 ku。重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后获得具有生物活性的蛋白,在体外能够明显促进小鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖活性,与轮状病毒共同免疫小鼠能够提高轮状病毒VP6蛋白的特异性抗体水平,并提高抗原刺激下脾细胞分泌IFN-γ水平。本研究首次确认了proTα蛋白在小鼠体内具有佐剂活性,为proTα生物活性的进一步研究及其作为疫苗佐剂的开发奠定基础。     

A型清道夫受体在口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白诱导小鼠免疫应答中的作用

为研究A型清道夫受体(SR-A)在重组口蹄疫病毒(FMDV)VP1-VP4蛋白诱导小鼠产生抗免疫应答中的作用,通过构建Pet32a-VP1-VP4原核表达系统制备VP1-VP4蛋白,用纯化的VP1-VP4蛋白分别免疫预先注射SR-A抑制剂的BALB/c小鼠和未作处理的BALB/c小鼠,用ELISA检测免疫7d后小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量,用琼脂扩散法测血清的抗体效价,用ELISA检测血清抗体亚类的含量。结果发现,经SR-A抑制剂处理的小鼠血清IFN-γ含量和IL-4含量均降低,血清总抗体效价也降低,但血清IgA水平显著升高,这表明SR-A在识别VP1-VP4蛋白进而启动免疫应答的过程中发挥广泛的调节作用。     

牛源犬新孢子虫NcGRA9基因原核表达及免疫原性分析

为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性，本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因，构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性，应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示，经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段，表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性；重组蛋白接种BALB/c小鼠后，免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性，为新孢子虫病的防控奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表达及免疫原性分析

为在大肠杆菌中表达出高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒并检测其免疫原性,将扩增的7种融合标签(GST、NusA、MBP、PpiB、γ-crystallin、ArsC和Grifin)片段连在VP2-LS3基因的N端,构建7个带有不同标签的重组原核表达载体。再将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,筛选出显著促进VP2-LS3蛋白可溶性表达的融合标签,并进行大量诱导表达、纯化。纯化得到的VP2-LS3重组蛋白分别进行TEV酶酶切、电镜观察分析及免疫家兔,并对获得的兔抗VP2血清进行Western blot和间接ELISA分析。结果显示,与其他6个标签相比,MBP标签促进VP2-LS3蛋白的可溶性表达具有显著性,可溶性表达水平达到69.5%;TEV酶可以把His6-MBP标签蛋白与VP2-LS3蛋白分开,获得高纯度的VP2-LS3蛋白;镜检显示形成了LS3蛋白笼纳米颗粒;Western blot结果表明,表达的VP2-LS3重组蛋白可与兔抗血清发生特异性反应,而不与阴性对照血清发生反应;间接ELISA检测制备的兔抗VP2血清效价达到1∶12 800。本研究获得了高可溶性的VP2-LS3蛋白笼纳米颗粒,为传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程疫苗的研发奠定基础。     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

负载口蹄疫病毒VPl-VP4融合蛋白质的树突状细胞对T细胞的活化效应

为研究负载口蹄疫病毒VPl－VP4融合蛋白质的树突状细胞对淋巴结T细胞的活化效应,通过构建pET32a-VPl－VP4原核表达系统制备VPl－VP4融合蛋白。将纯化VPl－VP4融合蛋白负载骨髓源树突状细胞（BMDC）后与淋巴结T细胞共培养,用ELISA检测不同时间点的共培养上清液中IFN－γ的含量。结果表明,负载FMDVVPl－VP4融合蛋白后的BMDC可通过溶酶体－MHC－Ⅱ类分子途径有效地激活淋巴结T细胞,从而启动Thl细胞免疫应答,分泌大量IFN－γ。     

滴鼻途径感染猪血凝性脑脊髓炎病毒小鼠的免疫动态变化

应用石蜡切片、ELISA等方法,通过对小鼠脾脏病理组织学观察以及脾脏指数、IL-2、IFN-γ和TNF-α等重要细胞因子的检测,研究猪血凝性脑脊髓炎病毒（Hemagglutinatingencephalomyelitisvirus,HEV）感染不同周龄（4、6周龄）BALB／c小鼠后的免疫动态变化特点。结果显示,无论是4周龄还是6周龄小鼠,在被HEV感染后的1～3d,脾小体生发中心增大并在红髓有多量浆细胞出现,第4天脾小体开始缩小,其周边和中央动脉周围有多量淋巴细胞聚集,到第5天脾小体生发中心消失并在其周边和中央动脉周围淋巴细胞增多。另外,脾脏指数和血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-4浓度均呈现先升高后降低的趋势,IL-2含量变化不明显,而IL-10含量较少几乎检测不到。结果表明,HEV感染初期,小鼠对侵入的病毒做出一定的免疫应答,但是随着病毒复制,病毒量的增大,小鼠的免疫反应受到抑制。同时不同周龄小鼠的被检指标降低或升高程度及持续时间不同,表明HEV的免疫、发病与小鼠感染年龄之间存在一定相关性。     

山羊免疫弓形虫代谢分泌抗原后的免疫应答

将山羊随机分为6组，即E／SA纽、E／SA＋cpG组（未乳化）、E／SA＋CpG组、E／SA＋IL-2组、E／SA＋IL-2＋CpG组、对照组，每组3只，分别于免疫前、免疫后第2周、免疫后第4周、感染后第1周及感染后第2周采集山羊外周全血及涂血片，IHA法检测抗体滴度的动态变化；ELISA法检测IFN-γ、TNF—a、IL-2、IL-4的表达水平；ANAE染色法检测T淋巴细胞的动态变化。结果显示，免疫后各免疫组的IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-4及T淋巴细胞水平显著高于对照组（P〈0．05），各免疫组的抗体水平均高于对照组。结果表明，E／SA可引起IFN—γ、TNF—a、IL-2、IL-4、T淋巴细胞及抗体水平的升高，说明E／SA免疫后可引起山羊较强的细胞免疫和体液免疫应答。     

虎源FPV主要抗原表位区基因的原核表达及免疫原性分析

为筛选出制备猫瘟热亚单位疫苗的最佳佐剂类型与首选抗原片段,本试验对虎源FPV-HLJ株VP2全长基因及其截短基因片段PAB进行原核表达,切胶法纯化的表达蛋白经Western blot分析后,分别与氢氧化铝胶佐剂及弗氏佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法检测小鼠体液免疫水平,初步评价各疫苗的免疫效果。结果表明:VP2、PAB融合蛋白主要以包涵体形式表达,切胶法获得的高纯度表达蛋白均能与鼠抗虎源FPV阳性血清发生特异性反应。纯化蛋白各佐剂免疫组免疫小鼠后均引起较强的特异性抗体IgG反应,其中PAB蛋白各免疫佐剂组抗体水平明显高于VP2蛋白相应免疫佐剂组,且PAB蛋白+氢氧化铝胶组与PAB蛋白+弗氏佐剂组抗体水平无显著差异(P0.05),但与未加佐剂组差异显著(P0.01)。研究证实,PAB蛋白具有良好的免疫原性,可与氢氧化铝胶佐剂协同用于FPV亚单位疫苗的制备。     

Mucosal mRNA Cytokines’ Profile of Gastric Wall in Neonatal Foals: Comparison with Endoscopy and Histology

Gastritis and gastric ulcerations occur frequently in neonatal foals. The relationship between cytokines expressed by gastric mucosa and gastric histopathology in healthy or sick foals has never been investigated. The aim of this study was to compare the histological diagnosis and endoscopic view with cytokine expression (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-8, IL-13, and IFN-γ) of gastric mucosa. Twenty-two foals were definitively enrolled in the study: 19 were critically ill, and 3 were healthy foals. Gastric biopsy specimens were collected for histological examination and for cytokine mRNA qualitative real-time PCR analysis. This study shows that there is a substantial agreement between histology and endoscopy and that foals with evidence of gastritis and gastric ulcerations have higher probability of expressing TNF-α. Moreover, the overall profile of cytokines expression, with a low percentage of IFN-γ, a high percentage of IL-4, and the absence of IL-13, suggests a down-regulation of the Th1 cell-mediated immune response and an impaired Th2 response in the gastric wall in the neonatal period.     

骨髓源肥大细胞通过甘露糖受体识别FMDV-VLPs的细胞因子应答

为了研究骨髓源肥大细胞（BMMCs）通过甘露糖受体对口蹄疫病毒样颗粒（FMDV-VLPs）的细胞因子应答效应，本研究构建了重组pCMV-HA-HBcAg-VP1-VP4质粒，并转染CHO-K1细胞以制备FMDV-VLPs。用FMDV-VLPs负载经甘露糖受体（MR）抑制剂Mannan处理的BMMCs （iMR-VLP组），并设置只负载FMDV-VLPs组（VLP组）和单纯细胞组（Control组）作为对照，收集细胞上清液，用细胞因子芯片检测不同处理组BMMCs细胞上清中细胞因子的含量。结果显示：与Control组相比，VLPs组BMMCs表达IL-1α、IL-2、IL-4、IL-15、IL-17A、IL-21、TNF-α、IFN-γ、CC17和CCL21均显著上调（P<0.05），而IL-10没有显著变化，iMR-VLP组BMMCs表达IL-1α、IL-2、IL-4、IL-15、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、CCL-17和L-Selectin显著下调（P<0.05），而IL-9、IL-10、CCL19和CCL21的表达则呈上调变化。综上所述，FMDV-VLPs可以促进BMMCs一系列细胞因子的分泌，而抑制MR后，BMMCs分泌细胞因子能力受到了一定程度的抑制，表明FMDV-VLPs可能通过BMMCs的甘露糖受体增强Th1型细胞因子分泌、有效抑制能引起免疫抑制的IL-10的分泌，并降低介导T细胞的再循环的CCL19和CCL21的形成。研究结果为基于肥大细胞甘露糖受体应答效应的口蹄疫新型疫苗的研发提供了理论依据和新思路。     

The effect of adenosine on pro-inflammatory cytokine production by porcine T cells

Adenosine is a well described anti-inflammatory modulator of immune responses. The aim of the present study was to describe the role of common adenosine agonist 5'-N-ethylcarboxamidoadenosine (NECA) in cytokine production by main porcine T cell subpopulations. TNF-α, IFN-γ, IL-2 and IL-10 were detected by multicolor flow cytometry together with cell surface markers CD3, CD4 and CD8. It was found that NECA inhibits (in a dose-dependent manner) production of pro-inflammatory TNF-α and Th1-associated cytokines IFN-γ, IL-2 in all concanavalin A-stimulated T cell subpopulations. Moreover, production of IL-10 was potentiated in all T cell subpopulations tested. These corresponded well with the fact that all T cell subsets expressed mRNA for adenosine receptor (AR) subtypes to comparable extents. Contrary to concanavalin A-stimulated cells, NECA had a moderate effect on PMA-stimulated T cells, suggesting that AR in pigs acts via signaling pathways not associated with protein-kinase C. Non-selective antagonist CGS15943 as well as allosteric modulator SCH202676 failed to reverse the effect of NECA in pigs. In conclusion, NECA has an anti-inflammatory effect on porcine T cell subpopulations.     

硒对树突状细胞和巨噬细胞功能的调控作用

旨在探讨硒对树突状细胞（dendritic cells,DCs）和巨噬细胞功能的影响,试验将硒分别与髓源性树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells,BMDCs）和腹腔巨噬细胞共同培养后,用流式细胞术检测未成熟BMDCs和巨噬细胞的吞噬活性以及BMDCs上的MHCⅡ、CD86、CD80和CD40的表达量,测定经硒处理后的成熟BMDCs对刺激同种异体淋巴细胞增殖和抗原递呈能力,并用ELISA检测BMDCs和巨噬细胞上清液中细胞因子（IL-12、IL-1β、IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α、NO）水平的变化。结果显示,当硒的质量浓度在0.18~0.09 mg·L^-1时,BMDCs和巨噬细胞的吞噬活性显著增强（P<0.05）,并且BMDCs上的MHCⅡ、CD86和CD80的表达量显著升高（P<0.05）,对刺激同种异体淋巴细胞的增殖和抗原递呈能力也显著增强（P<0.05）。此外,在BMDCs的上清中,IFN-γ、IL-12和IL-10的含量显著升高（P<0.05）;在巨噬细胞的上清中,IFN-γ、TNF-α和NO的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,一定质量浓度的硒可以增强树突状细胞和腹腔巨噬细胞的功能,值得进一步探究硒对免疫功能的影响。     

猪O型口蹄疫病毒重组结构蛋白的纯化及间接ELISA方法的建立

将猪O型口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus,FMDV）的VP0、VP1、VP3基因,通过SUMO融合表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达,获得大小为55、48和40 ku的融合蛋白,Western blotting检测结果表明,表达的蛋白质具有良好的生物学活性。采用亲和层析法纯化表达产物,分别以纯化的SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3蛋白为抗原建立了FMDV的间接ELISA检测方法。200份田间血清样品的检测结果表明建立的SUMO-VP0-ELISA、SUMO-VP1-ELISA、SUMO-VP3-ELISA检测方法均具有良好的特异性和敏感性。