鸡新城疫云南分离株HN基因序列测定和分析

用RT—PCR法对分离自云南省的2株鸡新城疫病毒(编号YN—C1、YN—C2)进行HN基因的扩增和克隆．并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明：2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为l716nt；二者之间的核苷酸同源性为95．3％，氨基酸同源性为95．8％；YN—C1毒株与参考毒株GD／1／98／Go核苷酸、氨基酸同源性均最高，分别为97．9％和97．6％；YN—C2毒株与参考毒株JS／5／01／Go核苷酸同源性最高为98．5％，而与参考毒株JS／3／98／Go氨基酸同源性最高为98．1%。     

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV）,分别命名为QL和ZZ—ll,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,2个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96．8％～98．1％和96．9％～98．4％,处在IB—DV超强毒株分支上;而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89．7％～90．4％和90．0％～90．7％,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ—11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777～782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ—11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。     

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(ZJ2000)基因组A节段全长cDNA的克隆和序列分析

以传染性法氏囊病病毒（IBDV）浙江分离株（ZJ2000）基因组RNA为模板，采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了IBDV ZJ2000株基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明，克隆的A节段全长共3259个核苷酸，包括5'、3'端的非编码区（NCRs）和2个部分重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与参比的血清1型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2％－99．2％。二级结构预测表明，在5'-NCRs存在1个大型的茎环发夹结构。ORF2编码145个氨基酸的VP5，与参比毒株的同源性高达98．6％－100％。ORF1编码1012个氨基酸的VP2／VP4／VP3，在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比毒株的同源性分别达到94．9％－98．8、96．1％－98．5％、97．1％－99．2％。ZJ2000共有14－38氨基酸的替代，其中特有氨基酸6个，变异大多数集中在VP2高变区，突变率达2．9％－11％。第2个小亲水区内280位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L。这2个突变可能与IBDV的抗原性有关。VP2－VP4剪切位点附近511和540位氨基酸的变异可能使ZJ2000株的毒力增强。分子系统进化树分析表明，ZJ2000与欧洲Cu-1株、P2株、CEF94株和中国Harbin株的有关最近，而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株D971 mRNA3和mRNA4cDNA的分子特征

参照已发表的鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)基因序列，设计合成了1对引物，经RT—PCR扩增得到了IBV国内分离株D971约1．3kb的片段，其中包含3a、3b、E及M蛋白基因的完整0RF，并将该片段进行了克隆和序列测定。与国内外部分IBV毒株序列比较表明：D9713a基因与CU—T2、D1466、DE072、M41、GA／99和UK／66的3a基因核苷酸序列同源性在83％～89％之间，氨基酸序列同源性为77％～91％，其中与CU—T2毒株的同源性最低(分别为83％和77％)；3b基因与上述毒株的对应核苷酸序列同源性在85％～95％之间，氨基酸序列同源性为72％～96％，与CU—T2的同源性最高(分别为95％和96％)；E蛋白基因与CU—T2、D1466、DE072、M41、Ark99、H52、Gray、GA／99和UK／66的核苷酸序列同源性在81％～86％之间，氨基酸序列同源性为74％～80％。不同毒株推导的E蛋白C末端表现不同特征，其中D971E蛋白C末端比CU—T2的时应区多9个氨基酸残基，而比本试验选用的其他参考毒株的相应区域短5～7个氨基酸残基。M基因与Cu—T2、DE072、Gray、M41、H120、H52、SD／97／02、LX4及D41的M基因核苷酸序列同源性在86％～91％之间，氨基酸序列同源性为85％～95％，其中与SD／97／02的同源性最高(分别为91％和95％)。对M蛋白的3个功能区进行序列比较发现，其N端第1～19位与SD／97／02的同源性最高，达90％，与CU—T2的同源性为80％，而与其他毒株同源性均低于61％；N端第20～100位含有3个跨膜蔬水区，D971与其他参考毒株比较，该部位第20～67位相对保守，其中与SD／97／02的同源性为100％，与其他毒株的同源性在97％以下；在推测的与核衣壳连接的C端，D971与SD／97／02在第101～182位同源性为100％，与疫苗株H52和H120及国内分离株LX4和D41的同源性为97％，而与本试验所选的国外参考毒株同源性在96％以下；在C端第184～219位D971与H52的同源性为100％，与H120和SD／97／02的同源性为97％，与其他毒株的同源性也在96％以下，而且在C末端第220～222及224位与上述国内外参考毒株均不同，国内外各毒株在该4个位点氨基酸为丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸，而D971M蛋白的该区域氨基酸突变为丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸和甘氨酸，该突变是否与D971的生物学特性尤其是组织嗜性的变化相关还有待于进一步研究。以上结果表明，D971与SD／97／02亲缘关系较其他毒株为近，但其遗传衍化又与国内使用的疫苗株H52和H120具有一定的联系。从其mRNA3和mRNA4cDNA的序列分析来看，D971又具有独特的分子特征。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

本研究选取有代表意义的9株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）国内分离株．利用所设计的一对特异引物，通过RT—PCR的方法成功地扩增了膜蛋白基因即M基因全长片段．通过克隆、序列测定获得了9个分离毒株M基因的全长核苷酸序列。并将各IBV国内分离株与GenBank中注册的一些毒株的M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较、系统进化关系分析发现：IBV中国地方分离毒株大部分属于Mass型；不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异，从ATG至第150bp区段的核苷酸序列变异频率最高；IBV中国地方分离株M基因的变异属于高频率的同义突变；国内的IBV分离株分为两个基因群，1群分离毒株与GenBank中Mass型的毒株亲缘关系较近．毒株间核苷酸序列同源性为95．7%～100％，其相应的氨基酸序列同源性为98．2%～100%；Ⅱ群分离毒株与众多参考毒株的亲缘关系都比较远，毒株间彼此核苷酸序列同源性为89．7％～91．9%，氮基酸序列同源性为92．0-96．0%。     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2对引物，对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定，其基因序列全长均为1662bp，编码553个氨基酸，均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV参考株的F基因序列进行了比较。结果表明，核苷酸序列的同源性为82．6％～98．1％，氨基酸的同源性为87．7％～98．7％。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(^112R—R—Q—K／R—R—F^117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明，10株NDV广西分离株中GX1／00、GX2／00、GX4／00、GX6／02、GX7／02、GX9／03、GX10／03和GX11／03为基因Ⅶd亚型，GX3／00和GX5／00为基因Ⅲ型。     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒(IBDV)YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析，并和相关毒株进行了比较。结果表明，YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有92．5％和91．8％，与超强毒株UK661的核苷酸和氨基酸同源性均为97．6％，而与当地鸡群中分离的超强毒株HN942的核苷酸和氨基酸同源性则高达98．1％和98．4%，该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。     

TGEV的sM、M和N基因克隆及特征分析

参照(3enBank中收录的TGEV sM、M和N基因序列各设计1对特异引物，经RT-PCR扩增获得了TS株的相应基因片段，分别约为346、932和1217bp，其大小与预计的目的片段相符。与其他毒株的相应基因相比较，并经剪接后，TS株的sM、M和N基因全长分别为248、789和1149bp，各编码82个、262个和382个氨基酸；TS株与Purdue株、TF1株和96-1933株的sM基因核苷酸序列同源性分别为95．2％、92．7％和90．2％；推导氨基酸的同源性分别为95．9％、97．2％、98．8％；与Purdue株、TFl株、TGEVH株和96-1933株的M基因核苷酸序列同源性分别为95．2％、98．0％、99．6％和95．0％；推导氨基酸的同源性分别为97．0％、97．3％、98．5％、93．5％；与Purdue株、TF1株、FS722／70株、Korea株、TO14株、TC；EVH株和96-1933株的N基因核苷酸序列同源性分别为98．1％、97．7％、99．0％、98．3％、99．2％、99．0％和95．9％，推导氨基酸的同源性分别为97．9％、98．4％、99．0％、97．7％、99．5％、96．2％、96．6％。并对TS株基因间的保守序列和sM、M和N基因及其编码的相应氨基酸的结构特征进行了分析，发现sM和N基因在TGEV中保守；并提示在我国不仅存在有2个不同亚基因型的TGEV，而且我国的TGEV可能是输入性的。     

鸡传染性法氏囊病病毒基因组A片段cDNA序列分析

用鸡胚成纤维细胞繁殖鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）天水毒株。用提纯的病毒颗粒提取基因组RNA。根据已报道的英国52／70株的序列设计引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得1558bp和1590bp两个部分重叠的片段。结果表明，所克隆片段为3099的IBDV大开放读框。经与已报道的多个毒株相应序列比较后发现，核苷酸同源性介于97.4%-99.8%之间，推导的氨基酸同源性介于98.1%-99.5%。     

猪轮状病毒GD株VP6基因的克隆及序列分析

参考GenBank中发表的PRV OSU毒株VP6基因核苷酸序列ORF两端保守区序列,设计1对特异引物,以PRV GD株反转录cDNA为模板,通过PCR方法扩增出长约1.4 kb的基因片段,并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明:VP6基因全长1320 bp,含有一个1194bp的开放阅读框,编码397个氨基酸。与国内外已知的11个毒株VP6基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较,同源性分别为76.5%-95.6%和88.7%-99.2%;核苷酸系统发育进化树结果表明,GD毒株与轮状病毒JL94,CN86,OSU毒株亲缘关系较近,为一个进化群。     

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(TL2004)A节段cDNA的克隆及序列分析

用Long accurate RT—PCR（LA-PCR）的方法一步法克隆了IBDV TL2004基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明：克隆的A节段全长3260个核苷酸，包括5＇、3＇的非编码区（NCRs）和2个重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2％～99．2％。二级结构分析表明，在5＇-NCRs和3＇-NCRs各存在一个大型的颈环发夹结构。ORF1编码1012个氨基酸的VP2-VP3-VP4，在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比Ⅰ型毒株的同源性分别达96．7％～99．6％、94．2％～99．2％、96．7％～99．6％。ORF2编码145个氨基酸的VP5，与参比I型毒株的同源性高达95．9％～99．3％。TL2004在第2个小亲水区内279位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L，这2个突变可能是IBDV抗原漂变的原因。分子系统进化树分析表明，TL2004与欧洲Cu21株和中国JD1、Harbin株的关系较近．而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。     

传染性法氏囊病病毒强毒株HB／11的分离与鉴定

2011年8月,从河南省疑似传染性法氏囊病鸡群采集病料,通过鸡胚接种、琼脂扩散试验和RT-PCR等方法,证实分离的病毒为传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV）,命名为HB／11株。序列分析表明,HB／11株VP2基因的核苷酸序列与GenBank中发表的部分国内外IBDV超强毒株VP2基因序列相似性在99％左右;HB／11株VP2高变区基因含有七肽基序为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。动物回归试验表明,30日龄鸡群接种该毒株后引起鸡群发病率为100％,死亡率为70％,剖检可见鸡传染性法氏囊病典型病变。因此该病毒为IBDV强毒株。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因序列分析

利用RT-PCR分段扩增的方法,扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中山分离株(ZS-GD株)、珠海分离株(ZH-GD株)覆盖全长基因组的10个片段,分别克隆入pMD18-T载体进行序列测定,获得了PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株基因组全长15320 bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株全基因组序列进行了遗传进化分析,结果显示PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株与美洲型参考株的核苷酸序列相似性分别为88.1%~97.8%和88.4%~98.0%;与欧洲型参考株(Lelystad)的核苷酸序列相似性分别为60.6%和60.4%,且在2株毒的Nsp2蛋白上有30个aa的缺失,表明PRRSV ZS-GD株和ZH-GD株均为美洲型分离株的缺失变异株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

鸡传染性法氏囊病病毒地方流行毒株的免疫原性

从河北省一些发病鸡场分离到JD1～JD10共10株鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)毒株,用IBD标准阳性血清以琼扩试验进行了初步鉴定.并进行了IBDV分离物及其鸡胚适应毒免疫原对标准强毒IBDV-BC6/85株免疫保护试验,D78弱毒疫苗对IBDV各分离毒株的免疫保护试验以及分离毒株间交互免疫保护试验.结果表明,D78疫苗对JD2,JD5和JD10 IBDV分离株的保护率较低,分别为40%、50%和60%.分离毒株JD5、JD2及其鸡胚传代物E-JD2对强毒株的免疫保护率可达100%.交互免疫保护试验表明,JD2对其余各分离株的免疫保护指数达到80%以上,对标准强毒株和地方分离株均可产生有效免疫保护.     

上海及新疆地区猪戊型肝炎病毒开放阅读码框架2序列的克隆与分析

通过已建立的动物戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）RT-nPCR方法,检测上海地区和新疆地区猪群样品。扩增HEV开放读码框架2（open reading frame 2,ORF2）保守区,产物为507 bp。经克隆、测序,获得20株上海株、3株新疆株序列,采用分子生物学软件与47株已知HEV进行同源性、进化关系分析。结果23株序列从同源性比对和进化关系分析均属HEVⅣ型,上海株间507 bp的核苷酸同源性为94.1%~100.0%,与上海猪源（DQ450072）、日本人源Japan1（AB369690）亲缘关系近;3株新疆株507 bp间的核苷酸同源性为86.1%~98.2%,与新疆猪源China SW1（AY594199）、中国人源T1株（AJ272108）亲缘关系近;上海株与新疆株间的核苷酸同源性为82.6%~100.0%,提示上海株与新疆株间存在差异。23株HEV在时间和地域关系分析,提示不同年份的新疆株存在差异,同年份不同猪场的新疆株进化关系存在差异,不同年份、不同区县的上海株进化关系也存在差异。     

不同毒株猪细小病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用PCR扩增了猪细小病毒NJ-1株、NJ-2株、7909株和Vaccine株的VP2基因,分别克隆于pGEM-TEasy载体中,测定其核苷酸序列,并推导出相应的氨基酸序列,对其核苷酸和氨基酸序列进行分析和同源性比较。所测4个序列中,NJ-1株、NJ-2株和7909株序列均为1437bp,共编码479个氨基酸;而Vaccine序列为657bp,比其他毒株缺失780bp,共编码219个氨基酸。将所得4个序列与GenBank中NADL-2株、Kresse株、China株及VR-1株相应的核苷酸及氨基酸进行同源性比较,发现其核苷酸和氨基酸的同源性分别在97.7%~99.9%和97.2%~99.2%之间,具有高度同源性;通过绘制系统进化树可知,分离自国内的China株、NJ-1株、NJ-2株、7909株及Vaccine株亲缘性最为相近,与其他毒株的亲缘关系较远。