重组鸡白介素18真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的研究

通过对孵化率、平均囊指数、脾指数、外周血淋巴细胞增殖反应和白介素18（IL-18）蛋白水平表达的检测,评定了重组鸡真核表达质粒（pCI-ChIL-18）胚胎接种的不同接种剂量和接种方法的效果。结果表明,pCI-ChlL-18质粒接种18日龄鸡胚不影响孵化率,对鸡的生长发育无影响,不同的接种途径和接种剂量对鸡体内IL-18的表达有影响。与1日龄雏鸡肌肉接种比较,胚胎接种可明显促进外周血淋巴细胞的早期增殖,而且呈剂量依赖性,但相同接种途径的200μg接种组与300μg接种组间无统计学差异（P〉0．05）。     

IBDV VP2/4/3与ChIL-18融合基因真核表达质粒和基因共表达质粒的免疫原性比较

为比较已构建的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组质粒的免疫原性、进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用,本研究将2周龄SPF鸡随机分为6组,以200μg/羽剂量首免:A组免疫重组真核表达重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18,B组免疫pCI-ChIL-18-VP2/4/3,C组免疫pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18,D组免疫pCI-VP2/4/3,E组免疫pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3,F组为空白对照,2周后以相同剂量二免,通过观察外周血淋巴细胞增殖效果,测定血清IBDV中和抗体水平、血清ELISA抗体水平和攻毒保护试验等,比较各试验组IBDV DNA疫苗的免疫原性。试验发现:重组质粒pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18的保护效果最好,保护率达93.3%;pCI-VP2/4/3-ChIL-18免疫效果次之,保护率达80.0%;pCI-ChIL-18-VP2/4/3与pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3的免疫效果无显著差异,保护率均为73.3%;但均优于单独使用重组质粒pCI-VP2/4/3组,保护率为60.0%。本实验为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。     

猪圆环病毒Ⅰ型全基因组的克隆及生物信息学分析

猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）是引起临床断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的主要病原之一,而与之遗传相关的猪圆环病毒Ⅰ型（PCVI）无致病性。本研究从病猪的脾脏通过PCR扩增并成功克隆了PCV1的全基因组,在此基础上,对GenBank中发表的所有31株PCV1以及部分PCV2（60株）进行了生物信息学分析。PCV1株间遗传与分子进化分析结果表明：PCV1可分为基因Ⅰ型与基因Ⅱ型两种基因型。PCV1与PCV2之间基因组结构和功能区分析结果表明：PCV1和PCV2基因组之间在复制起始区等功能区高度保守,在主要的编码区,尤其是编码Cap蛋白的ORF2,存在着许多差异。     

稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立

根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株VP2基因序列设计1对引物,将该基因成功克隆到真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed2-N1-VP2(简称PVP2);以PVP2作为过渡载体,运用PCR定点突变技术,对第279位点和第284位点的氨基酸残基分别或同时进行突变,共构建P279、P284和PDA 3株突变体;在此基础上构建能稳定表达HZ2株IBDV及其突变体VP2蛋白的Vero细胞系,间接免疫荧光试验检测表明,Vero细胞系中IBDV VP2蛋白已成功表达.这为进一步深入研究IBDV毒力及抗原变异致病机制奠定了基础;此外,利用定点突变技术改造VP2蛋白,建立不同毒力的突变体,在探求高效、廉价的IBDV DNA疫苗上也有广阔的应用前景和重要意义.     

基于RNA聚合酶Ⅱ的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

应用重叠PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,然后分别将含有核酶序列的A、B节段构建到pCI真核栽体当中,构建真核载体pCI-ma核pCI-mb.在脂质体介导下,将pCI-ma和pCI-mb共转染Vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.     

传染性法氏囊病病毒浙江分离株(TL2004)A节段cDNA的克隆及序列分析

用Long accurate RT—PCR（LA-PCR）的方法一步法克隆了IBDV TL2004基因组A节段全长cDNA。序列测定结果表明：克隆的A节段全长3260个核苷酸，包括5＇、3＇的非编码区（NCRs）和2个重叠的开放阅读框（ORF1和ORF2），与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达95．2％～99．2％。二级结构分析表明，在5＇-NCRs和3＇-NCRs各存在一个大型的颈环发夹结构。ORF1编码1012个氨基酸的VP2-VP3-VP4，在氨基酸水平上VP2、VP3、VP4与参比Ⅰ型毒株的同源性分别达96．7％～99．6％、94．2％～99．2％、96．7％～99．6％。ORF2编码145个氨基酸的VP5，与参比I型毒株的同源性高达95．9％～99．3％。TL2004在第2个小亲水区内279位氨基酸由S替代了N、290位M替代了L，这2个突变可能是IBDV抗原漂变的原因。分子系统进化树分析表明，TL2004与欧洲Cu21株和中国JD1、Harbin株的关系较近．而与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。     

基于T7 RNA聚合酶的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

    为了建立传染性法氏囊病病毒反向遗传系统,应用PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,然后分别将含有T7启动子和核酶HDV序列的A、B节段构建到载体PT-Pluc当中,构建感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3(含T7 RNA聚合酶基因,能稳定表达T7 RNA聚合酶)预先感染1 h的vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验、电镜观察和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.     

副溶血弧菌ZJ2003株两种铁调外膜蛋白的克隆、表达和免疫原性

从浙江省象山港网箱养殖大黄鱼病鱼分离的一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ZJ2003中克隆了两种铁调外膜蛋白psuA和pvuA的基因(GenBank登录号:DQ141607、DQ141608),经PCR的方法去除两基因的信号肽编码序列后亚克隆到原核表达载体pET30a( )中,经IPTG诱导获得大量表达。表达的重组蛋白以包涵体形式存在。包涵体蛋白经尿素法纯化及梯度透析法复性后以100μg/尾的剂量免疫大黄鱼,4周后经活菌攻毒获得80%的免疫保护率。免疫印迹分析表明,人工感染存活鱼的血清可以识别此两种重组蛋白。研究结果显示该两种铁调外膜蛋白具有良好的免疫原性,有可能作为高效疫苗成份。     

鸡传染性法氏囊病病毒(ZJ2000)基因组B节段全长的克隆及其毒力位点的分析预测

将本实验室保存的ZJ2000株囊毒加生理盐水研磨后接种9～10日龄鸡胚增殖病毒，收集尿囊液透析纯化，用蛋白酶K法提取病毒基因组dsRNA。通过RT-PCR获得基因组B节段全长的eDNA。并将其克隆到PUC18-T载体中进行测序。同时，本研究对GenBank中登录的IBDV基因组B节段进行了大量分析，发现B节段的5＇-NCR存在1个基因高突变区，并且ZJ2000株的5＇-NCR可形成独特的二级结构。经过对VP1一级结构的大量分析，筛选出B节段中17个可能对IBDV毒力产生影响的候选毒力位点，并在此基础上又对这些位点氨基酸的特性进行统计分析，进一步探讨了这些位点对VP1功能影响的可能性，为深入研究IBDV基因组B节段对其毒力的影响作了有益的探索。     

IBDV VP2/4/3、ChIL-18共表达载体的构建及在Vero细胞上的表达

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)DNA疫苗的免疫效果,应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension)将IBDV VP2/4/3基因与鸡白细胞介素18(ChIL-18)基因分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-ChIL-18和ChIL-18-VP2/4/3,将融合基因片段定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18和pCI-ChIL-18-VP2/4/3;应用PCR法,在本实验室已成功构建的重组真核表达载体pCI-VP2/4/3和pCI-ChIL-18的基础上,构建VP2/4/3基因和ChIL-18基因的共表达载体co-pCI-VP2/4/3-ChIL-18。在脂质体介导下将上述重组真核表达载体转染Vero细胞,间接免疫荧光证实重组质粒能正常表达目的蛋白,表达的蛋白具有免疫反应性。这为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。