重组鸡白介素18真核表达质粒(pCI-ChIL-18)胚胎接种的研究

通过对孵化率、平均囊指数、脾指数、外周血淋巴细胞增殖反应和白介素18（IL-18）蛋白水平表达的检测,评定了重组鸡真核表达质粒（pCI-ChIL-18）胚胎接种的不同接种剂量和接种方法的效果。结果表明,pCI-ChlL-18质粒接种18日龄鸡胚不影响孵化率,对鸡的生长发育无影响,不同的接种途径和接种剂量对鸡体内IL-18的表达有影响。与1日龄雏鸡肌肉接种比较,胚胎接种可明显促进外周血淋巴细胞的早期增殖,而且呈剂量依赖性,但相同接种途径的200μg接种组与300μg接种组间无统计学差异（P〉0．05）。     

一株多重耐药中华鳖源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定

从患典型鳃腺炎病中华鳖（Pelodiscus sinensis）肝脏和腹水处进行细菌接种，分离获得一株细菌。综合菌落形态，16 S rRNA 序列进化分析和 API 细菌生化鉴定系统判定，所得菌株为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）（SX43）。动物回归实验显示，分离株对小鼠的半数致死量（LD50）为106．5 CFU，显示该菌株具有较强的致病性，可从实验幼鳖体内再次分离到相同的病原菌。常用药物的抗菌敏感性测定显示，菌株 SX43对头孢哌酮、头孢曲松、头孢呋辛、复方新诺明、氯霉素高度敏感。     

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

    为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200 μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P＜0.05).     

一例青鱼暴发性体表溃烂病的诊治

正青鱼,亦称黑鲩、螺蛳青,为我国主要淡水养殖品种,是"四大家鱼"之一。2015年8月,杭州市一养殖场暴发青鱼疫情,病原具宿主专一性,同一水域内鲫鱼、白鲢、花鲢等未见明显症状;发病青鱼不分规格大小,病鱼主要表现为体表溃烂,溃烂位置不一,直径2~3厘米,鳃糜烂;解剖可见肠道充血,肾脏异常肿大充血,呈紫红色。发病青鱼出现持续性死亡,日死亡率可达5%以上。     

稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立

根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株VP2基因序列设计1对引物,将该基因成功克隆到真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed2-N1-VP2(简称PVP2);以PVP2作为过渡载体,运用PCR定点突变技术,对第279位点和第284位点的氨基酸残基分别或同时进行突变,共构建P279、P284和PDA 3株突变体;在此基础上构建能稳定表达HZ2株IBDV及其突变体VP2蛋白的Vero细胞系,间接免疫荧光试验检测表明,Vero细胞系中IBDV VP2蛋白已成功表达.这为进一步深入研究IBDV毒力及抗原变异致病机制奠定了基础;此外,利用定点突变技术改造VP2蛋白,建立不同毒力的突变体,在探求高效、廉价的IBDV DNA疫苗上也有广阔的应用前景和重要意义.     

IBDV VP2/4/3与ChIL-18融合基因真核表达质粒和基因共表达质粒的免疫原性比较

为比较已构建的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组质粒的免疫原性、进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用,本研究将2周龄SPF鸡随机分为6组,以200μg/羽剂量首免:A组免疫重组真核表达重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18,B组免疫pCI-ChIL-18-VP2/4/3,C组免疫pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18,D组免疫pCI-VP2/4/3,E组免疫pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3,F组为空白对照,2周后以相同剂量二免,通过观察外周血淋巴细胞增殖效果,测定血清IBDV中和抗体水平、血清ELISA抗体水平和攻毒保护试验等,比较各试验组IBDV DNA疫苗的免疫原性。试验发现:重组质粒pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18的保护效果最好,保护率达93.3%;pCI-VP2/4/3-ChIL-18免疫效果次之,保护率达80.0%;pCI-ChIL-18-VP2/4/3与pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3的免疫效果无显著差异,保护率均为73.3%;但均优于单独使用重组质粒pCI-VP2/4/3组,保护率为60.0%。本实验为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。     

猪圆环病毒Ⅰ型全基因组的克隆及生物信息学分析

猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）是引起临床断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）的主要病原之一,而与之遗传相关的猪圆环病毒Ⅰ型（PCVI）无致病性。本研究从病猪的脾脏通过PCR扩增并成功克隆了PCV1的全基因组,在此基础上,对GenBank中发表的所有31株PCV1以及部分PCV2（60株）进行了生物信息学分析。PCV1株间遗传与分子进化分析结果表明：PCV1可分为基因Ⅰ型与基因Ⅱ型两种基因型。PCV1与PCV2之间基因组结构和功能区分析结果表明：PCV1和PCV2基因组之间在复制起始区等功能区高度保守,在主要的编码区,尤其是编码Cap蛋白的ORF2,存在着许多差异。     

重组甲基转移酶致弱水疱性口炎病毒的致病性与免疫原性

为了研究有效的水疱性口炎病毒疫苗,控制水疱性口炎疾病的蔓延,用甲基化能力致弱的重组水疱性口炎病毒VSV-E1764A,VSV-S1827A,VSV-Y1650A和VSV-F1691A作为疫苗,通过口腔灌服途径将1×106 PFU的重组病毒接种5周龄BALB/c小鼠,研究以上重组病毒的致病性和免疫原性.结果表明:重组病毒VSV-S1827A,VSV-Y1650A和VSV-F1691A对小鼠的致病性减弱,而VSV-E1764A仍然具有较强的致病性；免疫后的小鼠用野生型水疱性口炎病毒(VSV)进行攻毒,发现VSV-S1827A和VSV-Y1650A能够诱导高水平的中和抗体,从而保护小鼠免于攻击.总之,甲基化酶致弱的水疱性口炎病毒VSV-S1827A和VSV-Y1650A不仅对动物的致病性减弱,而且表现出良好的免疫原性；因此,甲基化酶致弱的水疱性口炎病毒可能成为有良好开发前景的活疫苗.     

基于T7 RNA聚合酶的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

    为了建立传染性法氏囊病病毒反向遗传系统,应用PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,然后分别将含有T7启动子和核酶HDV序列的A、B节段构建到载体PT-Pluc当中,构建感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3(含T7 RNA聚合酶基因,能稳定表达T7 RNA聚合酶)预先感染1 h的vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验、电镜观察和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.     

基于RNA聚合酶Ⅱ的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

应用重叠PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,然后分别将含有核酶序列的A、B节段构建到pCI真核栽体当中,构建真核载体pCI-ma核pCI-mb.在脂质体介导下,将pCI-ma和pCI-mb共转染Vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.