多株猪源大肠杆菌结构抗原和分泌抗原的研究

选取6株(300、303、316、325、327和343)猪源大肠杆菌免疫家兔制备高免血清,与6株菌的全菌抗原、菌体(O)抗原、渗透因子及外膜蛋白抗原分别进行交叉凝集试验和琼脂扩散试验。结果表明,大肠杆菌的主要抗原为O抗原,其中300和303 2株菌的抗体与其他4株菌的抗原具有广泛的交叉性。     

牛源多杀性巴氏杆菌新型交叉保护性抗原的筛选

为了筛选多杀性巴氏杆菌潜在的交叉保护性抗原,首先对牛源多杀性巴氏杆菌PmCQ2株(A型)、PmCQ6株(A型)、PmB株(B型)、PmF株(F型)全基因组序列进行分泌蛋白及膜蛋白预测,并使用Signal、TMMHM在线分析筛选到48个候选共有抗原基因;然后分别克隆于pET-28α中构建原核重组表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测获得31个重组表达蛋白。间接ELISA检测重组蛋白对3种不同血清型牛多杀性巴氏杆菌多抗的反应原性,发现13个重组蛋白具有较强的反应原性。最后选择5个重组蛋白免疫小鼠后,分别采用10LD50PmCQ2、PmB和PmF进行攻毒保护性试验,结果显示:r-PmCQ2_1g0376免疫后的小鼠对PmCQ2和PmB的攻毒保护率为50%和30%,对PmF则没有保护性;r-PmCQ2_4g0132免疫后对PmCQ2、PmB和PmF株的攻毒保护率分别为80%,20%和10%;r-PmCQ2_1g0311免疫后的小鼠对PmCQ2的攻毒保护率为30%,对PmB和PmF株均无保护性。本试验筛选出2个交叉保护性抗原,可以不同程度保护同源或异源菌株的攻击,为多杀性巴氏杆菌新型疫苗候选蛋白的筛选奠定了基础。     

大肠埃希氏菌血清型鉴定及黏着素抗原的测定

对95株已鉴定的大肠埃希氏菌，采用玻板凝集法进行了O抗原血清型的鉴定，确定46株为O抗原血清型。同时采用免疫荧光技术和D-甘露糖抗血凝反应（MRHA）及其抑制试验测定，确定为O抗原血清型的大肠埃希氏菌的黏着素抗原，其中23株具有K88、K99、987P3种黏着素抗原。结果表明，同时采用上述2种方法筛选大肠埃希氏菌的黏着素抗原，其准确性和灵敏性更高。     

纤维素酶和复合益生菌对全株玉米青贮品质的影响

本试验旨在研究纤维素酶和复合益生菌对全株玉米青贮品质的影响。以全株玉米为材料,试验分为对照组(不含添加剂)、纤维素酶组(添加1 g/kg纤维素酶)、复合益生菌组(添加2 mL/kg复合益生菌,植物乳杆菌∶酿酒酵母=1∶1)、菌酶联合组(添加1 g/kg纤维素酶和2 mL/kg复合益生菌),每组3个重复。青贮45 d后,测定全株玉米青贮的营养成分、发酵品质和微生物菌落数,分析纤维素酶和复合益生菌对全株玉米青贮品质的影响。结果表明:1)纤维素酶组和菌酶联合组全株玉米青贮中的粗蛋白质含量均显著高于对照组(P0.05);与对照组相比,菌酶联合处理显著降低了全株玉米青贮的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和纤维素的含量(P0.05)。2)与对照组相比,各试验组全株玉米青贮的感官品质得到提高,可溶性碳水化合物含量和pH显著降低(P0.05);菌酶联合处理显著降低了全株玉米青贮的氨态氮/总氮(P0.05)。3)与对照组相比,菌酶联合处理显著降低了全株玉米青贮中的乳酸菌、酵母菌和需氧菌的数量(P0.05)。本试验得出,纤维素酶和复合益生菌的联合处理有效提高了全株玉米青贮的营养价值和品质。     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗生产用菌株的筛选

为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株，本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株，对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定，再将最小发病剂量定为攻毒剂量，进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示，11株分离株均具有较强的毒力，从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强，最小发病剂量分别约为2.0×10⁴、1.8×10³和2.3×10³CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性，不仅可以抵抗同源菌株的攻击，还能对同血清型异源菌株提供良好的保护，免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高，且与攻毒保护相关性较好，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×10⁸、1.0×10<...     

空肠弯曲菌共同抗原单克隆抗体的研制及其在细菌检验中的应用 Ⅱ.杂交瘤细胞株的建立及特性鉴定

应用B-淋巴细胞杂交瘤技术,建立了5株稳定分泌抗空肠弯曲菌共同抗原(CA)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(4A7,9D6、9C2、11A1、11D4)。在5株杂交瘤分泌的McAb中,有4株(4A7、9D6、11A1、11D4)针对CA中的耐热抗原成分,对其中4A7、9D6两株分泌的McAb进行免疫印迹分析表明,其与CA中大约为7.7×104u的蛋白移行带出现特异反应;一株(9C2)针对CA中的不耐热抗原成分。对杂交瘤细胞的核型分析表明,其染色体数在93-108之间。体外传代4个月,仍保持稳定分泌抗体的特性。这种McAb具有较强的特异性,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与参试的其它31种非弯曲菌属的细菌均为阴性反应。对不同地区、不同来源的516株空肠弯曲菌的鉴定表明,制备的McAb与现有空肠弯曲菌均出现阳性反应,与常规鉴定法的符合率为100％。     

对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)。在MRHA反应中,本菌能凝集人O型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人O型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K88和K99血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血凝。在体外小肠上皮细胞吸附试验中,本菌对仔猪小肠上皮细胞具有强烈的吸附作用;透射电镜和扫描电镜观察证实了FC株菌除表面具有一种纤毛样结构外,还能定居在仔猪小肠段。血清学试验结果表明,本菌的O抗原属于O101。K88和987P两种抗血清均不能凝集本菌,而K99和F41抗血清均可凝集。对纯化的FC株菌粘着素抗原作等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果表明,该菌的粘着素是由等电点分别为4.61和9.78,分子量分别为29500和17500的两种蛋白质抗原所组成。此外,用乳鼠胃内投服试验和兔肠结扎试验证明,该菌只产生热稳定肠毒素。总之,本菌是一株能产生ST的K99,F41的肠毒素型大肠杆菌。     

菌酶添加对喀斯特地区全株青贮玉米发酵品质和有氧稳定性的影响

试验旨在研究添加菌酶对喀斯特地区全株青贮玉米发酵品质和有氧稳定性的影响,为新型青贮菌剂的应用提供参考。以真空袋法青贮全株玉米,设5个试验组和1个对照组,分别为添加等量纯化水(对照组)、植物乳杆菌(试验A组)、纤维素分解菌(试验B组)、纤维素酶(试验C组)、植物乳杆菌+纤维素分解菌(试验AB组)、植物乳杆菌+纤维素酶(试验AC组)。其中植物乳杆菌添加1×10⁵CFU/g;纤维素分解菌为黑曲霉∶枯草芽孢杆菌=2∶1,添加量为3.0×10⁵、1.5×10⁵ CFU/g,纤维素酶按0.3%添加。发酵60 d后同时采样并测定全株玉米的发酵特性、乳酸菌数量、营养成分、有氧稳定性指标。结果表明：试验组均有微弱香味,对照组则气味较平淡,综合评分均到达一级;试验组pH均低于4.2,达到优质青贮料标准,C、AC组pH显著低于A、B、AB组(P<0.05);A、B、C组乳酸(LA)含量显著高于对照组(P<0.05);试验组乙酸(AA)含量高于对照组,但差异不显著(P>0.05),丙酸(PA)和丁酸(BA)均未检测出;A、B、...     

种鸭源猪丹毒丝菌分离及血清学调查

从发生生产性能异常的2个种鸭群中分离到2株革兰阳性丝状菌,经16S rRNA基因序列分析鉴定为猪丹毒丝菌。采用多重PCR对分离株编码表面保护性抗原(spa)基因进行扩增,分别获得大小约1 000 bp和900 bp的片段,判定为spaC型和spaB型。毒力检测结果表明,2个分离株对小鼠的半数致死量(LD50)分别为103CFU/0.2 mL和≤102CFU/0.2 mL。药敏试验结果表明,分离株对青霉素类和大部分头孢菌素类抗生素敏感,对氨基糖苷类等药物具有明显的抗性。为进一步了解猪丹毒丝菌对鸭群的感染情况,本研究采用生长凝集试验对来源于3个不同鸭场的种鸭群进行血清学调查,结果,抗丹毒丝菌抗体阳性率(抗体效价≥16)分别为82%、35%和20%,表明鸭群中广泛存在猪丹毒丝菌感染。     

西藏林芝地区全株玉米与三叶草混合青贮对微生物多样性的影响

试验旨在探究西藏林芝地区全株玉米和三叶草混合青贮对微生物菌群多样性的影响。试验以乳熟期全株玉米和三叶草为试验材料，共设6个处理组。A组、B组、C组为正常混合组，全株玉米和三叶草分别按照1∶2、1∶1、2∶1混匀；D组、E组、F组为青贮组，全株玉米和三叶草分别按照1∶2、1∶1、2∶1混匀青贮发酵60 d，每个处理5个重复。结果显示，全株玉米与三叶草混合青贮能够提高饲料粗灰分、粗脂肪含量，降低粗纤维及pH值，减少营养物质损失；E组青贮饲料的pH值及氨态氮(NH₃-N)含量在3个青贮组中较低。利用高通量测序技术，共检测到门水平和属水平排列前十、丰度大于1%的菌种有6种菌门和10种菌属，优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、蓝藻菌门，优势菌属依次为乳杆菌属、叶绿体属、明串珠菌属。E组厚壁菌门和乳杆菌属相对丰度高于其他组，表明E组对粗纤维降解率更高、产生乳酸能力更强。研究表明，考虑三叶草利用效率最大化和青贮饲料发酵品质，建议将全株玉米和三叶草以1∶1的比例混合青贮较为适宜。     

一例白眉长臂猿慢性腹泻的诊治及病原分离鉴定

在患慢性腹泻的1只白眉长臂猿粪便中分离出1株肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种(K pneumoniaesubsp ozaenae)和1株致病性大肠杆菌,经大肠杆菌因子血清鉴定为:O26:K60(B6);2株分离菌经药敏试验后,先采取百菌除和先锋霉素Ⅵ等敏感药物进行抗菌消炎治疗,后用参苓白术散和启脾丸调理脾胃功能,收到了满意效果。     

狐阴道加德纳氏菌菌株抗原性及免疫原性研究

对分离的 1 45株阴道加德纳氏菌进行抗原性测定 ,筛选出了抗原性优良的血清型代表株。通过免疫琼脂扩散试验证明了三个血清型间存在一条共同的抗原沉淀线。免疫原性测定表明 ,三个血清型代表株能产生特异的保护性抗体     

,斑丹毒丝菌SpaA的分段克隆及表达

为筛选表达量高且免疫原性强的红斑丹毒丝菌表面保护性抗原A(SpaA)的抗原片段,本研究根据该菌SpaA的结构和功能区将其设计为6个子片段和1个全长片段,采用PCR技术从红斑丹毒丝菌HG-1菌株中扩增出SpaA的7个抗原基因片段,利用原核表达系统克隆并表达后采用SDS-PAGE和western blot检测表达及纯化情况...     

大肠杆菌K_(88ac)与LT(A~-B~ )抗原基因质粒在猪霍乱沙门氏菌弱毒株中的表达

应用细菌质粒转化技术,将大肠杆菌K_(?)与LT(A~-B~ )抗原基因重组质粒转入猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株中.对获得的其中8个转化子进行鉴定的结果表明,转化的细菌仍保持沙门氏菌的形态、生化及抗原特性,同时可稳定地表达K(?)和LT-B两种抗原.用微量间接血凝试验、抗甘露糖豚鼠红细胞凝集试验(MRHA)、ELISA等对转化菌表达的K(?)抗原进行了测定,用间接免疫溶血试验对其表达的LT-B抗原进行了测定.结果,这两种抗原在转化的细菌中均可高效表达.电镜下观察,转化的细菌在其表面形成菌毛样结构.这种转化细菌表现出猪霍乱沙门氏菌与产肠毒素性大肠杆菌的两种抗原特性,为这种双价工程菌苗的研制提供了有价值的候选菌株.本研究结果还表明,猪霍乱沙门氏菌弱毒菌苗株可作为基因转化的有效受体菌.     

粤北地区梅花猪链球菌的分离鉴定和药敏试验

对来自粤北某梅花猪养殖基地存在的不同程度呼吸道症状和无症状梅花猪,采取鼻腔拭子进行细菌性疾病调查,通过对优势菌的观察、分离纯化、染色镜检、生理生化试验和16SrRNA基因序列比对分析,确定2株优势菌为猪链球菌。荚膜多糖抗原(CPS)基因分型确定1株为猪链球菌9型,另1株为28型。药敏试验结果表明,2株猪链球菌对12种抗菌药物敏感,对17种抗菌药物不敏感。     

组合添加剂对全株玉米青贮发酵特性及营养品质的影响

试验旨在探究青贮宝(乳酸菌粉,A)、丙酸钙(B)和孜然精油(C)3种不同类型的青贮添加剂组合对全株玉米青贮发酵特性和营养品质的影响。试验结果表明,以青贮宝、丙酸钙和孜然精油为主效应分析,青贮宝(A)对全株玉米青贮乙酸含量有显著影响(P0.05)。青贮宝(A)对全株玉米青贮ADF的含量有极显著影响(P0.01),A_2水平下各组ADF含量平均值高于A_1各组。丙酸钙(B)对全株玉米青贮丙酸的含量有极显著影响(P0.01)。B_2水平下各组丙酸含量平均高于B_1水平的各组。孜然精油(C)对全株玉米青贮发酵品质没有显著影响(P0.05),对NDF含量有显著影响(P0.05),C_2水平下各组NDF含量平均值低于C_1水平下的各组。从交互作用分析,添加剂A、B在淀粉含量上交互作用显著(P0.05),添加剂A、B在ADF含量上交互作用极显著(P0.01);添加剂A、C在ADL含量上交互作用极显著(P0.01);添加剂B、C在蛋白含量上交互作用显著(P0.05)。从影响全株玉米青贮发酵特性综合因素分析可知,组合A_2B_2C_2优于其他添加剂组合及对照组。从影响全株玉米青贮营养品质的综合因素可知,添加剂组A_2B_2C_1组营养品质高于其他添加剂组和对照组。A、B、C 3种添加剂适当组合能够有效改善全株玉米青贮发酵特性,提升营养品质。     

我国禽源多杀性巴氏杆菌血清型研究

本试验用Carter的荚膜群鉴定法和Heddlesten的热稳定抗原鉴定法对我国116株禽源多杀性巴氏杆菌进行了血清学分型研究。研究表明,A∶1型是我国最主要的血清型,占69.8%,其次为A∶1(14)型和A∶3(4)型,分别占6.8%和4.3%。并对我国目前使用和试用的8株禽霍乱弱毒菌苗株进行了定型,其中3株为A∶1型,与主要血清型相同,5株与主要血清型不一致。在A∶1型菌株中,大部分菌株的耐热抗原与1型标准血清反应,形成1条沉淀线,部分菌株(9株)形成2条沉淀线,表明在A∶1型菌株中还存在有抗原差异。     

抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备

以纯化的猪附红细胞体免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,经过间接ELISA方法、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定,共获得5株分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1H1、1H2、3A5、5B1和7E11,其单抗亚类鉴定分别属于IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b和IgG2b。这5株McAb均能与猪附红细胞体全菌蛋白发生特异性反应,而不与猪肺炎支原体、猪链球菌、大肠杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒发生反应,并且1H1、3A5和5B1能识别同一抗原位点,1H2和7E11识别另一抗原位点。     

湖南地区猪源多杀性巴氏杆菌部分保护性抗原基因分子流行病学调查

为探索多杀性巴氏杆菌(Pm)的保护性抗原基因在A与D血清型之间分布规律及其保守性,本研究通过对湖南地区分离的92株(A型:50株;D型:42株)猪源Pm的ompA、ompH、omp87、plpE、plpP、ptfA、fhab2、vacJ和tbpA等9种保护性抗原基因进行PCR检测。结果显示:在以上9种基因中ompA、ompH、omp87以及ptfA的检出率最高,均为100%;vacJ和plpP基因的检出率分别为91%和66%。而fhab2和plpE基因仅在A型菌株中检出,检出率分别为42%和40%。选取部分菌株,对其4种检出率为100%的基因进行测序显示,omp87的同源性介于99.1%~100%;ptfA的同源性介于97.2%~100%;ompA的同源性介于91.2%~100%;ompH的同源性介于84.6%~100%。此外,经抗原表位预测,omp A和ompH基因在部分抗原表位区域存在明显差异。本研究发现omp87和ptfA两个基因存在于本研究分离的92株猪源Pm,并且相当保守,该结果为巴氏杆菌基因工程亚单位疫苗开发过程中保护性抗原的选择提供了依据。     

鸡传染性支气管炎病毒血凝抑制试验抗原的研制

为应用血凝抑制(HI)试验检验鸡传染性支气管炎疫苗免疫效力(血清、卵黄抗体水平),建立了鸡传染性支气管炎病毒HI试验抗原的制备方法。该方法是通过选取抗原谱最广的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,经SPF鸡胚增殖培养36h后无菌收取鸡胚尿囊液,4℃、12 000r/min离心10min,上清用聚乙二醇(PEG)20000浓缩100倍;兔源A型产气荚膜梭菌中国标准株(C57-1株)37℃增殖培养18h,4℃、12 000r/min离心10min取上清,经PEG 20000透析袋浓缩5倍后通过0.20μm滤膜过滤除菌,然后将IBV液和A型产气荚膜梭菌菌液(含α毒素)二者按一定比例混合后经37℃恒温振荡感作2h,4℃经48h后制成。经大量试验表明,制备的IBV HI试验抗原效价高、稳定性好,可替代进口抗原应用于鸡群IBV疫苗免疫后血清抗体及卵黄抗体的HI效价检测。