鸭源致病性大肠杆菌O抗原与毒力基因检测及药敏试验

【目的】探究荣昌、大足和隆昌三地鸭大肠杆菌分离株的O抗原、毒力基因及耐药性。【方法】将2014年—2021年鸭病料中分离得到的107株细菌在无菌条件下接种于麦康凯培养基中划线进行培养纯化,通过16S rDNA基因扩增测序和生化试验进行细菌鉴定,采用PCR技术对O抗原和16种毒力基因进行检测,采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验。【结果】107株分离株鉴定为大肠杆菌;O抗原鉴定试验鉴定出9种O抗原,其中优势抗原为O78(37.00%)、O7(25.00%),O121和O145(均为15.00%),并检测到5株O78+O145和O7+O145融合株;共检测出11种毒力因子,其中强致病性毒力基因有Tsh基因(检出率为25.23%)、fyuA基因(检出率为31.78%)、estB基因(检出率为31.78%)、Vat基因(检出率为2.80%)、iucA基因(检出率为44.56%)。3种毒力基因ompA、yijP和ibeB的携带率最高,分别为100.00%、96.26%和85.98%;药敏试验结果表明分离株对氨基糖苷类药物、米诺环素和多黏菌素最为敏感,对大环内酯类药物和克林霉素耐药,分离株均为多重耐药菌,30.00%的分离株表现为7重耐药。【结论】本研究鉴定到107株鸭源致病性大肠杆菌,其致病性和耐药性较强,毒力基因携带情况和耐药性检测发现大肠杆菌的致病力与其耐药性存在一定关系;O抗原检测发现了5株新型O抗原融合株,优势O抗原不断变化,说明西南地区大肠杆菌遗传结构正发生变化,可能存在新的菌体抗原。本研究结果为中国西南地区鸭大肠杆菌病防控及疫苗制备提供依据。     

大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

为研制用于标定大肠杆菌菌体抗原(O抗原)单因子定型血清效价的抗原,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种,经条件优化确定了抗原制备的工艺。检测结果表明,当菌液调整至OD_(600 nm)值为0.147±0.026时,各型抗原的浓度为1×10~9CFU/m L,将其热处理后制备成反应抗原。按此吸光值各自制备3批抗原,3批抗原与血清的凝集价均分别一致,分别达到2~(11)(O2)、2~(12)(O7)及2~9(O74)。用180种大肠杆菌O抗原单因子定型血清对制备的抗原进行检测,制备的抗原仅与其对应型的血清发生特异性反应,与其余179种血清均不发生反应。研究结果显示,制备的抗原具有较好的稳定性及特异性,可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。     

大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

为研制用于标定大肠杆菌菌体抗原(O抗原)单因子定型血清效价的抗原,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种,经条件优化确定了抗原制备的工艺。检测结果表明,当菌液调整至OD600 nm值为0.147±0.026时,各型抗原的浓度为1×109CFU/m L,将其热处理后制备成反应抗原。按此吸光值各自制备3批抗原,3批抗原与血清的凝集价均分别一致,分别达到211(O2)、212(O7)及29(O74)。用180种大肠杆菌O抗原单因子定型血清对制备的抗原进行检测,制备的抗原仅与其对应型的血清发生特异性反应,与其余179种血清均不发生反应。研究结果显示,制备的抗原具有较好的稳定性及特异性,可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。     

5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备

本研究以大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)为菌种制备免疫抗原并免疫家兔,获得5种大肠杆菌O抗原定型原血清,而后制备多种吸收抗原以消除5种原血清的非特异性凝集素。通过微量凝集试验的方法,确定各血清的凝集价。最终确定了5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法,为进一步改进大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺提供了思路和依据。     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Wwl株(O78，OMP-3．Amp^R，K^5)和WD2株(O2，OMP-1，Amp^5．K^R)作为亲本菌株，采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体，以PEG作为助溶剂，进行原生质体融合，得到4株双耐药融合菌株，融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性，且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3，OMP-1)和O抗原(O78，O2)．表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清的制备

为研制大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种制备抗原免疫家兔,获得了定型原血清,并通过比较不同免疫程序及剂量优化了定型原血清的制备工艺。进而按照优化后的定型原血清制备工艺,以大肠杆菌参考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)为菌种制备抗原免疫家兔,获得了10种O抗原型定型原血清。将定型原血清分别与180种微量凝集试验抗原逐一反应,明确各原血清与非特异性抗原的交叉凝集价,通过用吸收抗原对原血清进行吸收及稀释的方法消除非特异性凝集,最终制备成大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清。血清质量评价结果表明,新制备的单因子定型血清性状为无色、淡黄色或黄色澄明液体,个别有少量絮状物;无菌生长;特异性良好;凝集效价为1︰2。研究结果显示,制备的大肠杆菌O抗原单因子定型血清具有较好的特异性,可以用于对临床分离大肠杆菌进行O抗原血清型鉴定。     

青海省规模化猪场仔猪水肿病病原的分离鉴定

从青海省西宁及海东各县养猪场送检及搜集的发生典型仔猪水肿病的死亡猪肝脏和肠系膜淋巴结,分离鉴定出48株溶血性大肠杆菌,用25种大肠杆菌O抗原单价血清进行了血清学鉴定.结果表明48株分离菌有32株能定型,分属6种血清型,其中以O8(11/32)、O139(8/32)、O149(6/32)、O141(5/32)4种为优势血清型.同一猪场存在多种血清型,大多数猪场有本场的优势血清型;同一地区的不同猪场流行的主要血清型一般不同;不同地区猪场的优势血清型有的相同,有的不同.     

重庆市致病性大肠杆菌的血清型鉴定

从重庆市各地发生典型仔猪黄、白痢猪的肛拭粪样及死亡猪的心血和肝脏中分离鉴定出173株致病性大肠杆菌,用20种大肠杆菌O抗原单价血清进行了血清学鉴定。结果表明:173株分离菌有87株能定型,分属14种血清型,其中以O101(17.2%)、O8(14.9%)、O20(14.9%)、O64(11.5%)、O45(9.2%)、O149(8%)等6种为优势血清型。同一地区存在多种血清型,大多数地区有本地的优势血清型。不同地区的优势血清型有的相同,有的不同。     

一对斑马“猝死综合症”的诊断

2003年3月31日,兰州市动物园1对斑马突然暴亡,经尸体剖检和实验室检验,从采取的脏器及组织分离出大量高致病力的大肠杆菌,经中国兽医药品监察所对2株大肠杆菌血型O、K抗原鉴定,结果一株为O2和O74混合型,另一株为O6;但K抗原血清鉴定未获结果。初步确诊该对斑马死亡是高致病力的大肠杆菌所致。     

牛布鲁菌O链A抗原的提纯鉴定及种特异性单克隆抗体的研制

应用热酚法提纯牛布鲁菌544A的O链,经Sephades G-50纯化后,琼脂糖凝胶免疫扩散和SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定,用牛布鲁菌544A株全菌体免疫BALB/c小鼠,用纯化的O链筛选出4株针对O链表面A抗原的种特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B8、1C9、1G9和1E2,4株单克隆抗体均不与羊布鲁菌16 M、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、鼠伤寒沙门菌、放线杆菌发生交叉反应,具有高特异性,其中4B8的亲和常数达到了8.99×108M-1,适合用于鉴定牛种布鲁菌的研究。     

山东省鸡源致病性大肠杆菌O-抗原混合血清型分析

采用抗原抗体凝集反应,用常见的18种O因子血清测定从临床上分离鉴定的182株大肠杆菌的O抗原血清型。结果显示,山东地区鸡源大肠杆菌的优势血清型为O24,O15,O2,O127,O1,O18,O78,占检测菌株的41.21%,同时出现大量混合血清型,占检测菌株的24.18%。这是国内首次报道检测到大量的大肠杆菌O因子混合血清型,印证了国外研究人员对O-AGC核苷酸序列研究的结果,有助于最终对O抗原血清型进行更加准确的分类以及大肠杆菌疫苗的研制。     

鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融合菌株的构建

以鸡大肠杆菌Ww1株(O78,OMP-3,AmpR,KS)和WD2株(O2,OMP-1,AmpS,KR)作为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备原生质体,以PEG作为助溶剂,进行原生质体融合,得到4株双耐药融合菌株,融合菌株的形态、染色特性和生化特性均符合大肠杆菌的特性,且均能同时表达两个亲本菌株的外膜蛋白(OMP)抗原(OMP-3,OMP-1)和O抗原(O78,O2),表明两个亲本菌株发生了融合和染色体重组。经多次传代证明融合菌株是稳定的。     

张家口地区鸡致病性大肠埃希菌的分离鉴定与耐药性监测

从张家口地区鸡场怀疑患大肠杆菌病的病死鸡的肝脏、心包等组织中分离鉴定出27株大肠杆菌,对其进行大肠埃希菌O群抗原鉴定,共有6种O型血清型,O18、O78、O76为优势血清型,未定型菌3株,占待检菌株的11.1%;对27株分离菌进行抗生素敏感性试验,所有菌株对硝基呋喃类抗生素(NFT)和头孢菌素类抗生素(CFZ、CED)极度敏感,对其它抗生素的敏感性则各不相同。     

枣庄地区仔猪腹泻大肠杆菌O抗原血清型调查

为掌握枣庄地区致仔猪腹泻大肠杆菌的流行情况,阐明O抗原血清型分布,在枣庄市下属各县(市、区)部分养猪场采集病料,进行了大肠杆菌的分离培养、生化试验、O-抗原血清型鉴定、毒力试验及致病性回归试验等相关研究。结果表明:分离株分属于16个血清型:O15、O25、O27、O44、O45、O63、O78、O85、O125、O126、O127、O128、O142、O143、O152、O158,其中O15(10株)、O44(14株)、O45(11株)、O63(20株)、O78(8株)、O126(15株)血清型菌株占到总量的67.2%;毒力试验结果显示O44、O45、O126三种血清型致病力最强。说明枣庄地区致仔猪腹泻大肠杆菌有独特的血清型构成,在疾病防治过程中应引起重视。     

大肠埃希氏菌血清型鉴定及黏着素抗原的测定

对95株已鉴定的大肠埃希氏菌，采用玻板凝集法进行了O抗原血清型的鉴定，确定46株为O抗原血清型。同时采用免疫荧光技术和D-甘露糖抗血凝反应（MRHA）及其抑制试验测定，确定为O抗原血清型的大肠埃希氏菌的黏着素抗原，其中23株具有K88、K99、987P3种黏着素抗原。结果表明，同时采用上述2种方法筛选大肠埃希氏菌的黏着素抗原，其准确性和灵敏性更高。     

空肠弯曲菌共同抗原单克隆抗体的研制及其在细菌检验中应用的研究——Ⅰ.共同抗原的提取与鉴定

选用鸡源、猪源空肠弯曲菌各4株提取共同抗原。对提取的共同抗原用等电聚焦电泳分析,出现6～7条移行带,其等电点在3.32～5.23之间;免疫原性测定,共同抗原稀释至10～20μg/ml时,ELISA试验,与5株空肠弯曲菌高免血清均出现阳性反应。用共同抗原免疫家兔及BALB/C小鼠,所制免疫血清,以玻片凝集试验、协同凝集试验及免疫酶染色法对56株不同来源(鸡源20株、猪源33株、人源3株)的空弯菌进行鉴定,均出现阳性结果。试验结果还表明,在不同来源的菌株之间,其共同抗原成分的含量及免疫性以无明显差异。     

云南部分地区仔猪大肠杆菌分离鉴定

采自云南昆明、曲靖、楚雄、大理、玉溪、保山等州(市)规模化养猪场疑似仔猪黄、白痢的病(死)猪直肠棉拭子、十二指肠和肠系膜淋巴结病料,分离158株大肠杆菌。通过40种主要致病性大肠埃希氏菌O抗原的血清型鉴定,除46株未能定型、6株自凝外,鉴定出106株分离株的O抗原血清型。这些分离株覆盖了23个血清型,其中O24、O119、O88、O8、O9、O85这6种血清型的菌株占总分离菌株的39.24%、占定型菌株的58.49%,为分离株的优势血清型。这些血清型与已报道的常见血清型间存在一定差异,O24、O119作为猪致病性大肠杆菌优势血清型在我国少见报道。     

空肠弯曲菌共同抗原单克隆抗体的研制及其在细菌检验中的应用 Ⅱ.杂交瘤细胞株的建立及特性鉴定

应用B-淋巴细胞杂交瘤技术,建立了5株稳定分泌抗空肠弯曲菌共同抗原(CA)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(4A7,9D6、9C2、11A1、11D4)。在5株杂交瘤分泌的McAb中,有4株(4A7、9D6、11A1、11D4)针对CA中的耐热抗原成分,对其中4A7、9D6两株分泌的McAb进行免疫印迹分析表明,其与CA中大约为7.7×104u的蛋白移行带出现特异反应;一株(9C2)针对CA中的不耐热抗原成分。对杂交瘤细胞的核型分析表明,其染色体数在93-108之间。体外传代4个月,仍保持稳定分泌抗体的特性。这种McAb具有较强的特异性,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与参试的其它31种非弯曲菌属的细菌均为阴性反应。对不同地区、不同来源的516株空肠弯曲菌的鉴定表明,制备的McAb与现有空肠弯曲菌均出现阳性反应,与常规鉴定法的符合率为100％。     

布鲁氏菌M28强毒株O抗原聚合酶基因缺失株的构建及其毒力评价

为构建布鲁氏菌O抗原聚合酶缺失突变株,本研究以布鲁氏菌M28株为亲本株,利用同源重组方法,以编码O抗原聚合酶靶基因M28_ B0107基因ORF外侧序列作为同源臂构建重组质粒pSP-B0107-K,将其电转化至M28感受态细胞中,以卡那霉素抗性基因(Kanr)作为标记,筛选缺失突变株(M28-△B0107).M28-△B0107经过20余代传代培养,Kanr表达稳定.将M28-△B0107与M28以106 cfu剂量腹腔接种小鼠,进行体内致病性试验.结果显示,M28-△B0107感染组小鼠脾脏荷菌量显著低于亲本M28株感染组,感染6周时,前者低于后者近10倍(p＜0.05);而且M28-△B0107感染组脾脏重量也显著低于M28强毒株组(p＜0.05);小鼠腹腔巨噬细胞系(RAW264.7)感染能力试验结果表明,突变株与亲本株无明显差异(p＞0.05).     

奶牛隐性乳房炎奶样中埃希氏大肠杆菌共同性抗原初探

用LMT的方法对新疆8个奶牛场采集的1020份奶样进行隐性乳房炎的检测,并对阳性样品进行了大肠杆菌的分离与鉴定。从不同牛场分离菌株中挑选8株用家兔制备免疫血清,用试管凝集对从乳房炎奶样分离出的其它21株大肠杆菌进行共同性抗原的筛选。结果显示,免疫血清效价达1∶2560～1∶5120,85.7%的待检菌株与其中3种血清凝集反应呈阳性。对制备血清的8株菌进行SDS-PAGE电泳分析,菌体蛋白图谱显示在20~84 ku处存在大量相同或相似的蛋白条带;用制备的免疫血清进行免疫印迹分析,与8株菌的菌体蛋白在70 ku处呈现明显的抗原抗体反应。说明这些菌株存在共同性抗原。