牛源多杀性巴氏杆菌血清分型及毒力相关基因的检测研究

为确定新疆北疆部分地区疑似病例中分离的牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)流行的血清型、ST型及毒力相关基因的分布情况,本研究以分离的17株牛源Pm为研究对象,采用荚膜多重PCR分型法、脂多糖多重PCR分型法(LPS-mPCR)、多位点序列分型法(MLST)及PCR方法检测17株Pm分离株的荚膜型、脂多糖型、MLST型及7类共25个毒力相关基因的分布情况。结果显示,13株Pm的荚膜脂多糖型为A∶L3型,ST型均为ST1型,4株Pm荚膜脂多糖型为B∶L2型,ST型均为ST44;17株Pm毒力相关基因(exbB、exbD、fimA、fur、hgbA、hsf2、nanB、oma87、ompA、ompH、plpB、psl、ptfA、sodA、sodC、tonB和tbpA)的检出率高达100%,toxA基因的检出率为0。结果表明,从新疆北疆部分地区规模化牛场疑似病例中分离的Pm主要血清型为A∶L3∶ST1型。     

猪源多杀性巴氏杆菌荚膜分型及外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内猪源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况及与荚膜型之间的相关性,本试验采用PCR方法对44株猪源多杀性巴氏杆菌进行荚膜分型和ompH基因的扩增测序。结果显示,44株菌株中22株为荚膜A型,17株为荚膜B型,5株为荚膜D型;44株菌株的ompH基因开放阅读框在1 002~1 056bp之间;SignaIP 4.1预测结果显示,信号肽为N端20个氨基酸残基;ProtParam分析结果显示,成熟蛋白氨基酸残基数量在313~331aa之间,推测的分子质量在33.83~36.46ku之间。序列分析结果显示,44株菌株核苷酸同源性为86.2%~100.0%,氨基酸同源性为86.0%~100.0%;ompH基因核苷酸序列遗传进化树结果显示,荚膜A型、B型和D型菌株分别在不同的分支。试验结果表明,猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因在不同血清型之间具有较高的同源性,与荚膜型之间存在相关性。     

牛源多杀性巴氏杆菌血清分型及毒力相关基因的检测研究

为确定新疆北疆部分地区疑似病例中分离的牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）流行的血清型、ST型及毒力相关基因的分布情况,本研究以分离的17株牛源Pm为研究对象,采用荚膜多重PCR分型法、脂多糖多重PCR分型法（LPS-mPCR）、多位点序列分型法（MLST）及PCR方法检测17株Pm分离株的荚膜型、脂多糖型、MLST型及7类共25个毒力相关基因的分布情况。结果显示,13株Pm的荚膜脂多糖型为A：L3型,ST型均为ST1型,4株Pm荚膜脂多糖型为B：L2型,ST型均为ST44;17株Pm毒力相关基因（exbB、exbD、fimA、fur、hgbA、hsf2、nanB、oma87、ompA、ompH、plpB、psl、ptfA、sodA、sodC、tonB和tbpA）的检出率高达100%,toxA基因的检出率为0。结果表明,从新疆北疆部分地区规模化牛场疑似病例中分离的Pm主要血清型为A：L3：ST1型。     

牛荚膜血清A型巴氏杆菌病的分子流行病学调查

本研究针对多杀性巴氏杆菌(Pm)特异性基因kmt1,进化保守基因16S rRNA基因,以及荚膜血清型A、B、D、E和F型对应的荚膜生物合成基因hayD-hayC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,设计特异性PCR扩增引物,采用PCR方法扩增相应基因和进行序列测定,并对分离菌株进行分子鉴定和同源性分析。结果显示,来自不同地区的分离菌株均含有Pm种特异性基因kmt1、A型荚膜生物合成基因hayD-hayC和16S rRNA基因。不同地区的分离株,kmt1基因的同源性为100%;A型荚膜生物合成基因hayD-hayC同源性大于99.9%;与国外牛源分离株的hayD-hayC基因的同源性大于98%;不同地区分离株的16S rRNA基因的同源性为100%,而与英国牛源分离株Pm338的16S rRNA基因的同源性高达99.93%。这些结果表明,在我国6个省市流行的牛出血性败血症由同一来源的荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致,与英国牛源A型分离株Pm338具有共同的进化来源。     

不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况,采用PCR方法对16株不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因进行扩增测序和分析。结果显示：16株菌株的ompH基因开放阅读框在1002～1056 bp之间;信号肽为N端20个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在313～331 aa之间,氨基酸同源性为82.1%～100%;基于ompH氨基酸序列的系统发育树中鸡源菌株（荚膜A型）、猪源和牛源菌株（荚膜B型）分别在不同的分支。序列分析结果表明,ompH基因序列差异与荚膜型之间存在相关性,而与毒力大小无相关性。     

8株禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）流行株外膜蛋白 H（OmpH）基因的变异情况,参考GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计1对特异性引物,采用PCR方法对不同来源的8株禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A、B、D）的OmpH基因进行扩增、测序。结果显示,11个菌株的OmpH基因开放阅读框在1002~1071 bp 之间;SignalIP 4.0预测结果表明,信号肽均为N端20个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在314~337 aa之间,推测的分子质量在33.76~37.04 ku之间。与GenBank中15个菌株OmpH基因序列比对结果发现,核苷酸同源性在84.9%~100.0%之间;氨基酸同源性在81.5%~100.0%之间;其中C48-1、1010、9003、890920、921012、XJ-e 6个国内禽Pm分离株OmpH序列同源性为100.0%。试验结果表明,国内禽Pm菌株OmpH基因非常保守。     

青藏高原禽源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)外膜蛋白H(ompH)基因的核苷酸序列,设计合成了一对特异性引物ompH3,用PCR方法扩增了1株禽源多杀性巴氏杆菌野生菌株(P1004)的ompH基因.然后将获得的928 bp的目的基因片段连接到pMD18-T载体上,进行多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆及序列分析.结果表明,P1004和标准菌株C47-8的ompH基因编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为62％和91.7％,与已知的9个国内外代表株进行比对分析,核苷酸序列的同源性在55.9％～65.2％之间,氨基酸序列的同源性在91.3％～91.7％之间,说明P1004的ompH基因序列与C47-8以及国内外代表株之间有明显差异,即变异明显,揭示了禽源多杀性巴氏杆菌的ompH基因与其他菌株的分子进化关系,为ompH基因应用于疫苗的可行性奠定了基础.     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

牛源多杀性巴氏杆菌Oma87基因的分子特征、抗原性及遗传进化分析

为研究牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)Oma87基因的分子特征及同源性,本研究对荚膜血清A型(capsular serotype A,Pm8)Oma87基因进行扩增、克隆和测序,利用在线软件对其进行分子特征、抗原性及遗传进化分析。结果显示,Oma87基因全长为2 376 bp,编码791个氨基酸;氨基酸序列分析发现,该蛋白为酸性的亲水性蛋白,稳定性高,具有信号肽结构但不存在跨膜区域;二、三级结构分析发现,该蛋白为无规则卷曲及多段延伸链所形成的"N"字型三维立体结构。遗传进化分析显示,新疆分离株Pm8 Oma87基因与其他不同地域的牛源A型Pm和部分猪源A型Pm的同源性较近,与其他型Pm的同源性较远;通过VaxiJen软件分析发现,Oma87蛋白的保护性抗原的总体预测值为0.5478,高于正常阈值0.4,证明Oma87蛋白可作为免疫原性蛋白,为进一步研究Oma87蛋白奠定了理论基础。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖(LPS)含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14d血清抗体达1∶64~1∶128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

牛源多杀性巴氏杆菌交叉保护性抗原的筛选

为筛选牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)交叉保护性抗原,本研究以A型Pm CQ2株基因组为模板,对其omp A、omp H、plp E、pm0979、P6和pfh B基因分别进行扩增,克隆于相应表达载体并进行原核表达,同时对表达产物进行纯化及western blot鉴定。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,分别测定其对2 LD50剂量的A型和B型Pm的攻毒保护效果。结果表明,重组蛋白r Omp A、r Omp H、r Plp E、r Pm0979、r P6和r Pfh B对A型Pm CQ2株的攻毒保护率分别为20%、60%、70%、40%、20%和10%,对B型Pm CVCC450株的攻毒保护率分别为0、30%、40%、20%、10%和0,表明重组蛋白r Plp E、r Omp H和r Pm0979可以针对不同血清型的Pm提供较好的交叉保护作用。本研究为牛源Pm新型疫苗的研制奠定了基础。     

牛源多杀性巴氏杆菌Oma87基因的分子特征、抗原性及遗传进化分析

为研究牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）Oma87基因的分子特征及同源性，本研究对荚膜血清A型（capsular serotype A，Pm8）Oma87基因进行扩增、克隆和测序，利用在线软件对其进行分子特征、抗原性及遗传进化分析。结果显示，Oma87基因全长为2 376 bp，编码791个氨基酸；氨基酸序列分析发现，该蛋白为酸性的亲水性蛋白，稳定性高，具有信号肽结构但不存在跨膜区域；二、三级结构分析发现，该蛋白为无规则卷曲及多段延伸链所形成的"N"字型三维立体结构。遗传进化分析显示，新疆分离株Pm8 Oma87基因与其他不同地域的牛源A型Pm和部分猪源A型Pm的同源性较近，与其他型Pm的同源性较远；通过VaxiJen软件分析发现，Oma87蛋白的保护性抗原的总体预测值为0.5478，高于正常阈值0.4，证明Oma87蛋白可作为免疫原性蛋白，为进一步研究Oma87蛋白奠定了理论基础。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌hyaD基因缺失株的构建及其在小鼠上的交叉保护性分析

hyaD为A型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成相关基因,为探讨该基因对多杀性巴氏杆菌毒力及其免疫保护特性的影响,本研究利用同源重组方法,构建了牛源A型多杀性巴氏杆菌CQ2株（PmCQ2）的hyaD基因缺失株（ΔhyaD）。结果发现,与野生株相比,ΔhyaD的荚膜产生量及其感染后在脏器中的细菌定殖量均显著下降,其毒力显著降低。细胞试验发现,ΔhyaD更易黏附于巨噬细胞,被吞噬数量显著多于野生株,致使巨噬细胞相关炎性因子表达显著上调。hyaD基因的缺失,可调控与荚膜合成、LPS合成转运、铁转运等相关的基因表达显著下调,促使相关保护性抗原基因表达显著上调。以制备的PmCQ2株和ΔhyaD株灭活苗免疫小鼠（加强免疫1次）,免疫后第21天分别采用同源和异源多杀性巴氏杆菌攻毒,ΔhyaD株免疫小鼠肺组织感染后24 h无明显或轻微病理损伤,对牛源A型、B型和F型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为100%、100%和80%,对兔源、猪源和禽源A型多杀性巴氏杆菌的免疫保护率分别为90%、100%、100%;而野生株PmCQ2除对牛源A型多杀性巴氏杆菌的保护率在80%以上外,对牛源B型和F型及兔、猪、禽源A型多杀性巴氏杆菌均无明显交叉保护作用。研究结果表明,hyaD基因可通过调控荚膜产生及毒力相关因子表达影响菌株毒力;hyaD基因缺失可调控相关交叉保护性抗原表达,赋予菌株交叉免疫保护特性。该研究为多杀性巴氏杆菌通用型疫苗的研发提供了参考。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌血清型鉴定及ompH基因序列分析

为分析牦牛多杀性巴氏杆菌(P.multocida)分离株与疫苗株的血清型和ompH基因差异,本研究利用PCR方法鉴定其血清型,并克隆、测序ompH全长基因,用DNAMAN、DNAStar对其进行生物信息学分析.结果显示,分离株与疫苗株血清型为B型,标准株血清型为E型.分离株和疫苗株ompH基因编码氨基酸有2个缺失和2个突变,同源性为99.4％.研究表明ompH基因具有很高的同源性,但氨基酸的缺失和突变可能使抗原表位发生变化,也是导致免疫失败的原因之一.     

青藏高原犬源多杀性巴氏杆菌种特异性KMT1基因的克隆与序列分析

为了研究青藏高原犬源多杀性巴氏杆菌(Pm)的KMT1基因与其他菌株的分子进化关系,试验采用PCR方法扩增了1株犬源Pm分离株P1202的种特异性KMT1基因,然后将获得的460 bp的目的基因片段连接到pMD18-T载体上,进行Pm KMT1基因的克隆及序列分析。结果表明:分离株KMT1基因编码区核苷酸序列与GenBank中发表的12株国内外Pm分离株的KMT1基因序列同源性为39%~72%。P1202株与FJ986389序列的同源性最高,为72%,说明二者进化途径较近,而与AY225344、AY225345、AY225346、AY225347序列的同源性较低,说明它们之间进化途径较远。     

猪源多杀性巴氏杆菌的生物学特性与ToxA基因鉴定

对17株分离自猪萎缩性鼻炎临床症状猪群的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),进行了生物学特性试验与ToxA基因鉴定。基于Pm对甘露醇、卫茅醇、山梨醇、海藻糖的发酵能力和产生鸟氨酸脱羧酶的特性,鉴定出10株Pm多杀亚种(P.multocidasubsp.multocida);7株Pm败血亚种(P.multocidasubsp.septica)。根据PCR荚膜分型结果,有8株A型,9株D型。针对ToxA基因中的1 230 bp片段,采用T1/T4引物,4株Pm分离菌株被确定为产毒多杀性巴氏杆菌(ToxingenicP.multocida,T+Pm),占23.53%(4/17)。同时对17株Pm分离株进行药物抗性测定和分析得知,17株Pm对青霉素、先锋霉素Ⅴ、卡那霉素、庆大霉素、丙氟哌酸、氟哌酸、多黏菌素B和利福平的敏感率均在52.9%~100%,而对链霉素和氯洁霉素均不太敏感。     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

禽巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因克隆及序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR方法扩增出禽巴氏杆菌5：A C48-1株的ompH全长片段，将ompH进行T—A克隆、序列测定和分析。结果表明，ompH全长1597bp，含有一个1056bp的开放性阅读框架（ORF），编码352个氨基酸，前20个氨基酸组成信号肽。与已知的15个血清型及痘苗株CU的ompH的核苷酸及其推导的氨基酸序列比较，核苷酸同源性在51．5％～98．7％之间，氨基酸同源性在39．3％～98，7％之间。氨基酸多序列比较显示，血清型特异性抗原表位位于60～80位和200～220位氨基酸处。     

副猪嗜血杆菌广东流行株的分离鉴定与基因分析

本研究从广东省各个地区送检病料中成功分离鉴定了4株副猪嗜血杆菌,并且针对副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性进行PCR检测和基因测序同源性分析,通过GenBank联机比对分析,所分离的菌株与国内外菌株16S rRNA序列同源性在98.2%以上,分离菌株之间同源性在99.6%~100%之间,证明了所暴发的菌株是副猪嗜血杆菌。     

鸡源鸭疫里默杆菌的分离鉴定及ompA基因遗传进化分析

从病死鸡肝脏中分离到8株革兰阴性多形杆菌,对8株分离株进行形态学和16S rDNA基因鉴定并分析ompA基因及其推导的蛋白序列遗传进化特征。16S rDNA进化分析显示,8株鸡源分离株与22株鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)参考株形成一个大的进化分支,与RA模式菌株ATCC11845和22株RA参考株之间的同源性分别为99.3%~99.8%和98.8%~100.0%。根据形态学和16S rDNA基因鉴定结果,将8株分离株鉴定为RA。ompA基因进化分析显示,8株鸡源RA分离株与3株鸭源RA分离株KML1、KML2、KML3以及1株鹅源RA分离株KS9901-G形成一个大的进化分支,同源性为94.0%~99.6%。与ATCC11845株相比较,8株鸡源RA分离株ompA基因均发生99个核苷酸位点的突变。OmpA蛋白进化分析显示,8株鸡源RA分离株形成一个独立的大的进化分支,同源性为100%。与ATCC11845株相比较,8株鸡源RA分离株OmpA蛋白均发生19个氨基酸位点的突变。8株鸡源RA分离株对青霉素、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩等10种抗生物敏感。本试验在国内分离到鸡源RA,证实鸡RA感染在我国的存在,对鸡RA感染的预防和控制具有重要指导意义。