硫酸酯化酵母β-葡聚糖抗H1N1猪流感病毒作用及对神经氨酸酶活性的影响

研究硫酸酯化酵母β-葡聚糖对H1N1猪流感病毒的体外抑制作用及对神经氨酸酶活性的影响。采用细胞感染模型,应用MTT法检测药物对MDCK细胞的半数毒性浓度(TC50)、半数抑制浓度(IC50)及治疗指数(TI),并结合神经氨酸酶抑制试验检测药物对其活性的影响。结果表明,硫酸酯化酵母β-葡聚糖对MDCK细胞最大无毒浓度为5.34 mg/m L,其半数抑制浓度(IC50)为0.58 mg/m L,治疗指数(TI)为18.0;当药物浓度≥1.25 mg/m L时,能明显降低H1N1猪流感病毒神经氨酸酶的活性。提示硫酸酯化酵母β-葡聚糖有确定的体外抑制H1N1猪流感病毒的作用,并能影响病毒神经氨酸酶的活性。     

清毒片体外抗H1N1亚型流感病毒的研究

以MDCK细胞为H1N1亚型流感病毒宿主,金刚烷胺为阳性对照药物,通过细胞病变效应(CPE)和噻唑蓝比色法(MTT)测定清毒片对病毒的3种不同作用方式,即先感染病毒后给药,先给药后感染病毒和药物病毒同时作用,每种方式3个重复,观察清毒片对H1N1亚型流感病毒的抑制作用。结果表明,中药清毒片具有不同形式的抗H1N1亚型流感病毒作用,抑制病毒在细胞内合成作用,阻止病毒吸附传入细胞作用和直接灭活病毒作用。清毒片抑制H1N1亚型流感病毒在细胞内合成作用的3个重复的半数有效浓度(EC50)分别为411、434、532μg/mL,治疗指数(TI)为3.5;清毒片阻止H1N1亚型流感病毒的吸附、传入细胞的3个重复的EC50分别为404、458、467μg/mL,TI为3.6;清毒片对H1N1亚型流感病毒直接灭活作用的3个重复的EC50分别为479、481、461μg/mL,TI为3.4。说明清毒片体外对H1N1亚型流感病毒株具有明显的抑制作用,为H1N1亚型流感病毒感染的治疗和临床用药提供了理论依据。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制.分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明...     

太子参须提取物对鸭流感病毒体外试验初探

为尝试性探究太子参须提取物对鸭H9N2亚型流感病毒体外生长的抑制作用,本文基于TCID50试验检测鸭H9N2亚型流感病毒体外感染不同处理组的MDCK细胞。结果表明,太子参须提取物高低剂量组(75%、25%)和黄芪多糖阳性对照组均对鸭H9N2亚型流感病毒体外生长产生抑制,且太子参须提取物高剂量组(75%)的抑制作用最优。结论:太子参须提取物对鸭H9N2亚型流感病毒在MDCK细胞上的体外增殖具有一定抑制作用,且呈相应剂量关系。     

广西1株H3N8型马流感病毒的分离与鉴定

对具有流感临床症状的病马组织经处理后接种SPF鸡胚,分离到1株流感病毒。该病毒经鸡胚接种7代后,出现稳定的对鸡红细胞凝集效价,效价为25,能被H3亚型血清中和,与H1、H5、H7、H9亚型阳性血清无交叉反应;对HA基因及NA基因进行序列分析,结果显示:HA基因与马流感病毒H3亚型同源性最高,NA基因与马流感病毒N8亚型同源性最高,判断该病毒属于H3N8亚型马流感病毒,命名A/EQ/Guangxi/01/09。     

大青叶中4（3H）喹唑酮体外抗H1N1型流感病毒的作用研究

目的：探讨大青叶中4（3H）喹唑酮体外抗H1N1型流感病毒的作用。方法：用MTT染色法测定大青叶中4（3H）喹唑酮通过不同加药方式对H1N1型流感病毒的体外抑制作用。结果：大青叶中4（3H）喹唑酮对H1N1型流感病毒具有明显的阻断作用和对细胞内病毒有抑制作用。结论：大青叶中4（3H）喹唑酮具有明显的体外阻止H1N1型流感病毒吸附到靶细胞和抑制H1N1型流感病毒增殖的作用。     

胎羊肾细胞用于增殖H1N1亚型流感病毒的初步研究

为研究胎羊肾细胞用于H1N1亚型流感病毒增殖的可能性,采用胰酶消化法从胎羊肾组织中分离肾细胞进行传代培养,并采用间接免疫荧光法检测细胞表面的流感病毒受体,采用直接血凝法测定病毒培养物的血凝价。结果表明,该细胞表面有较丰富的流感病毒受体,且α2,6-Gal受体的含量明显高于犬肾细胞(MDCK);用该细胞培养H1N1亚型流感病毒,其病毒培养物的血凝价达到29～210,略高于MDCK细胞的毒价;该细胞在体外连续传10代,其病毒培养物的血凝价没有明显改变。以上结果初步表明胎羊肾细胞可用于H1N1亚型流感病毒的增殖。     

中兽药复方对H_9N_2亚型禽流感病毒的抑制作用研究

禽流感(avian influenza, AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病,是集约化养鸡场的重要疫病之一。本研究分别建立H_9N_2亚型AIV感染MDCK细胞和鸡胚模型,探讨研发的中兽药复方制剂对H_9N_2 AIV的抑制作用。结果显示,中兽药复方制剂具有良好的安全性,制剂原液和各个稀释度对鸡胚基本没有毒性,制剂原液(200mg/mL)稀释102倍至2 mg/mL以下对体外培养的MDCK细胞基本无毒性;制剂原液(200 mg/mL)稀释104倍至0.02 mg/mL均能有效抑制H_9N_2 AIV在鸡胚中的增殖,稀释105倍至0.002mg/mL仍然对H_9N_2 AIV在MDCK细胞上的复制具有良好的预防和治疗效果,且预防效果优于治疗效果。结果表明本研究制备的中兽药复方具有良好的抗H_9N_2 AIV效果。     

盐酸阿比朵尔体外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

<正>目的检测盐酸阿比朵尔体外对2009新型流感病毒A(H1N1)复制的影响。方法采用2009新型流感病毒A(H1N1)感染MDCK细胞系统,检测盐酸阿比朵尔抗流感病毒的活性。血凝实验、细胞病变保护实验、RT-PCR和定量RT-PCR实验用于病毒滴度确定。使用Chou软     

H9N2流感病毒诱导MDCK细胞自噬对病毒复制的影响

本试验旨在研究H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬对病毒复制的影响。试验首先建立了稳定表达GFP-LC3的 MDCK细胞系,该细胞系经H9N2流感病毒感染后,激光共聚焦观察到了绿色荧光的点状聚集,得出H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发细胞自噬。随后试验利用3-MA抑制细胞自噬、Rapamycin诱导细胞自噬,荧光定量PCR检测NP mRNA水平,TCID50检测病毒的滴度进行细胞自噬与病毒复制的研究。结果表明： Rapamycin可显著增加NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01）|3-MA可以显著降低NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01)。说明H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬可促进流感病毒的复制。 [关键词] H9N2 流感病毒|细胞自噬|病毒复制|MDCK细胞|诱导     

古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。     

古典H1N1亚型猪流感病毒PB2 K627E突变对病毒复制能力的影响

旨在探索古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)PB2K627E突变对病毒复制能力的影响。利用反向遗传操作技术和点突变技术成功获得古典H1N1亚型猪流感病毒的拯救株(627K)和突变株(627E)后,分别在MDCK细胞和小鼠体内对拯救株和突变株的复制能力进行比较。体外MDCK细胞试验结果显示,突变株与拯救株相比,细胞病变(CPE)减小、空斑形态减小、生长曲线差异极其显著,表明突变株在MDCK细胞上的复制能力减弱。小鼠攻毒试验结果表明,突变株对小鼠体重变化的影响不明显,在小鼠肺中的病毒滴度明显下降,引起病理损伤较轻。体外MDCK细胞及小鼠攻毒试验结果均表明,突变株与拯救株相比复制能力降低。该结果不仅证实了猪流感病毒PB2 627位氨基酸是一种重要的毒力分子标记,同时还为进一步阐明其致病机制提供了条件。     

中草药抑制H_5亚型禽流感病毒对鸡胚毒性的研究

根据中医利用解表、清瘟、凉血止血的中草药防治人类流感的原理,选取金银花、北板蓝根、贯叶连翘、双黄连、贯众等五种中草药所制成的制剂进行H5亚型禽流感病毒感染鸡胚后毒力作用的抑制实验。首先对鸡胚接种禽流感H5亚型病毒,然后对感染鸡胚分别注射上述几种中药制剂,再抽取胚液进行HA和HI实验,将其中对鸡源H5-AIV有抑制作用的中草药挑选出来,测定中草药对禽流感病毒的治疗指数(Therapeutic index,TI)。然后采用寇氏法计算药物半数有效量ED50。结果表明,金银花、北板蓝根、贯叶连翘、双黄连、贯众五种中草药制剂在对H5亚型禽流感病毒的鸡胚毒性方面均有较好的抑制作用。     

H9N2亚型禽流感病毒细胞高产株的拯救

为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2) (SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出全部基因均来自亲本株的AIV rSH11株.生物学试验结果表明rSH11在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、遗传稳定性等方面均与亲本株保持一致,rSH11经MDCK细胞连续传5代后血凝价稳定在1∶1024,表明该病毒株具有细胞高度增殖的特性.采用rSH11株制备油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡,免疫一周即可以检测出HI抗体,免疫3周后HI抗体平均效价高于1∶700,表明其具有良好的免疫原性.rSH11疫苗对不同的H9N2病毒株能够产生良好的免疫保护作用,显著抑制免疫鸡排毒.H9N2亚型AIV细胞高产株的拯救为该亚型AIV细胞苗的研制奠定了基础.     

两株H1N1亚型猪流感病毒NS1蛋白抑制Ⅰ型IFN功能比较

本研究分离得到两株猪源H1N1流感病毒,通过进化树分析发现分别是欧亚类禽H1N1猪流感病毒和类鸭源H1N1猪流感病毒,为了研究两株毒株的NS1蛋白对Ⅰ型IFN产生的抑制能力,分别构建了2个毒株的NS1基因的真核表达载体,将NS1真核表达质粒、Ⅰ型IFN报告质粒与干扰素刺激质粒RIG-I共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测Ⅰ型IFN激活水平。结果显示:欧亚类禽H1N1猪流感病毒NS1蛋白对人源细胞干扰素的拮抗作用明显强于类鸭源H1N1猪流感病毒;2种NS1蛋白对RIG-I与TBK-1激活的IFN-I抑制能力存在显著的差别,但是对IRF-3激活的IFN-I抑制能力没有显著差别。本研究结果初步揭示了欧亚类禽与类鸭源H1N1猪流感病毒抑制IFN-I能力的差异,及H1N1禽流感适应猪群的潜在分子机制。     

H1N2亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／06分离鉴定和对猪致病性研究

2006年5月从广东某大型猪场采集具有流感症状保育猪鼻拭子共98份,无菌常规处理猪鼻拭子后接种MDCK细胞,分离到4株流感病毒.用血凝抑制和PCR方法鉴定均为H1N2亚型.挑选其中一株A/Swine/Guangdong/1/06(H1N2),进行全基因组测序,并与GenBank中相关序列进行比较.核苷酸同源性分析表明:A/Swine/Guangdong/1/06(HIN2)与A/Swine/Guangxi/13/06不同基因之间同源性为96.6%～98.1%.以106EID50的剂量,将H1N2病毒鼻腔感染35日龄仔猪,结果表明H1N2亚型流感病毒可以感染猪上呼吸道.但不表现临床症状.本研究结果对于揭示H1N2亚型猪流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义.     

复方戊二醛消毒剂对鸡禽流感病毒(H9 N2株)杀灭效果的研究

研究了一种复方戊二醛消毒剂对鸡禽流感病毒(AIV H9N2株)的杀灭效果及稳定性.将该消毒剂1:500稀释度的溶液在20℃条件下与等量2×105 EID50AIV(H9N2株)病毒液作用,10 min内可完全杀灭AIV(H9N2株)病毒;该消毒剂1:500稀释度的溶液在室温下放置2 d,仍能保持原有的消毒效果.     

中药复方对H9N2亚型禽流感病毒在MDCK细胞增殖的作用

为了筛选对H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）有独特防治效果的中药复方,本试验基于禽流感发病临床症状、结合中药复方用药基本原则,组方芩根提取液（Qingen extract,QG）,以奥司他韦（达菲,DF）为阳性对照药,通过研究药液对神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的抑制作用,采用CCK-8法测定药液对犬肾上皮细胞（MDCK）毒性作用,并从病毒吸附、增殖和灭活3个方面做了药效评价。结果表明,QG对NA的抑制作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性增高,半数抑制浓度（IC₅₀）约为1 130 μg/mL;QG和DF的最大安全浓度分别为2 500和500 μg/mL,H9N2 AIV的TCID₅₀为10^-4.36/100 μL;QG浓度为156.25~2 500 μg/mL范围内,对H9N2 AIV的病毒毒力有一定抑制作用,并在MDCK细胞上呈现出一定的抗吸附、抑制病毒复制作用。表明QG在对抗H9N2 AIV的NA活性、抑制H9N2 AIV吸附靶细胞和在细胞内复制有一定的作用。     

H9N2亚型禽流感病毒TJ1株的分离与鉴定

从发病蛋鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒TJ1株,对其进行了系统的生物学特性鉴定.结果表明,分离毒TJ1株具有血凝性,且凝集不被新城疫和产蛋下降综合征抗血清抑制,而被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清抑制,禽流感琼扩试验结果为阳性,在电镜下呈典型的流感病毒粒子形态,证明该毒株为A型流感病毒;通过致病力试验,分离毒TJ1株对6周龄SPF鸡无致病性,为低致病性毒株;用其制备成油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡,能很快产生对H9特异的血凝抑制抗体,于免疫后3周攻毒,可以保护雏鸡抵御同病毒攻击的感染,表明分离毒TJ1株具有良好的免疫原性.     

重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株的构建及免疫保护效力

以国内欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并将其克隆至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细胞,从而成功构建了重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株SH/PR8。以相同病毒剂量接种MDCK细胞,检测不同时间点的血凝效价,绘制病毒生长曲线,结果表明,重组病毒SH/PR8相对于原始野生株SH1在MDCK细胞上具有更高的病毒滴度。重组病毒SH/PR8制备的灭活疫苗经过一免和二免小鼠后,检测血清中血凝抑制抗体、中和抗体和IgG抗体,结果显示首免后抗体效价持续升高,4周后抗体效价达到峰值。小鼠攻毒试验结果表明,免疫组体质量下降不明显且未出现死亡,而非免疫组小鼠体质量持续下降并且于攻毒后6d小鼠出现100%死亡。肺脏组织病毒含量滴定以及组织病理学观察结果显示,免疫组能够有效抑制SH1病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。总之,本研究表明重组SH/PR8疫苗候选株相对于原始毒株SH1在MDCK细胞上具有更高的复制能力,制备的重组灭活疫苗能够诱导机体产生高水平的抗体,能够针对欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供很好的免疫保护。