广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种严重危害我国养猪业的烈性传染病。病毒囊膜糖蛋白E2是病毒识别和吸附宿主细胞的重要蛋白,同时也是病毒较不保守的蛋白,其编码基因常用于猪瘟病毒的遗传进化分析。为了分析我国猪瘟高发地区—广东省CSFV流行毒株的遗传多样性,本研究利用RT-PCR对采集自佛山等广东省11个城市的CSFV流行毒株E2全长基因进行了扩增和序列测定。系统进化分析表明16株CSFV流行毒株有15株为基因2.1亚型,另外1株属于基因1.1亚型。根据核苷酸同源性的大小,这些2.1亚型病毒株又可进一步划分为3个亚亚型2.1b、2.1c和2.1d。其中2.1c和2.1d亚亚型毒株是首次报道在该地区流行,到目前为止2.1a毒株尚未发现在广东省流行。多序列比对结果表明基因2.1亚型的4个亚亚型具有群特异性的氨基酸替换,这些结果进一步证实了2.1亚型的分型结果。综上所述,基于E2基因序列的系统进化分析和氨基酸多序列比对表明广东省CSFV流行毒株具有遗传多样性,同时发现有新的2.1c和2.1d亚亚型毒株的流行,这些研究结果将为我国广东省猪瘟防控策略的制定提供科学依据。     

2012—2018年山东省部分地区猪瘟分子流行病学研究

为了解山东省不同地区猪群中猪瘟病毒（CSFV）分子流行病学特点,采用RT-PCR方法,对2012—2018年收集到的79份临床疑似猪瘟病例组织样品,进行E2基因主要抗原区域扩增与序列测定,对获取的59个CSFV E2基因主要抗原区域序列进行遗传演化分析,并构建了遗传发育进化树。结果显示：7株CSFV属1.1亚型,其中有3个毒株的E2基因与疫苗株E2基因几乎一致,提示这7个毒株可能来自疫苗毒或为类疫苗毒株;SDJZ-15株归属2.1b亚型,其 E2基因推导氨基酸仅A51（丙氨酸）突变为V51（缬氨酸）;其他51个毒株属2.1d亚型,与2型CSFV的 E2基因主要抗原区（28~90 aa）氨基酸序列相比发生了4处突变,总体保持稳定。研究结果表明,2.1亚群中的2.1d分支CSFV是山东省当前的优势流行毒株。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒GZA株的分离鉴定及遗传变异分析

本研究收集贵州规模化猪场猪瘟净化过程中RT-PCR检测阳性病料,采用细胞接毒技术、病毒的形态结构观察和间接免疫荧光试验等分离鉴定了1株猪瘟病毒(CSFV),命名为CSFV GZA株,并对GZA株E2基因的核苷酸和氨基酸序列进行差异性分析。分离鉴定结果表明:接种PK-15细胞后连传7代RT-PCR均能扩增出CSFV特异性条带;病毒粒子在电镜下呈椭圆形或圆形,直径30～80nm;该毒株E2基因与参考毒株E2基因的核苷酸同源性82.8%～83.4%,氨基酸相似度88.7%～90.6%,并在713,725,729,734,738氨基酸位点发生改变;遗传进化树分析还得出GZA株E2基因与参考毒株遗传距离较远。说明本次分离株与其他流行株存在一定的差异,可为以后CSFV病原学的研究提供参考。     

表达CSFV E2蛋白重组AcNPV载体的构建

利用基因重组技术成功构建两株含猪瘟兔化弱毒株E2基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV),重组病毒能够在昆虫细胞中分泌表达CSFV E2蛋白。将重组病毒注射入家蚕蛹内,于注射后第7天收获蚕蛹血淋巴并进行Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果显示,重组病毒在家蚕蛹中成功表达了CSFV E2蛋白。本研究为进一步开发猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂盒用抗原提供了新的途径。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

猪瘟病毒云南流行毒株E2基因遗传变异分析

为了解云南省猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)流行毒株E2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR检测云南省疑似猪瘟阳性样品,并获取4株E2全基因序列。对所获的E2基因序列与国内外参考毒株进行同源性和遗传进化树比对分析。结果表明,获得4条全长均为1119bp的云南省CSFV流行毒株E2全基因序列。4株云南毒株序列的同源性为81.7%～99.6%,与疫苗毒株的同源性为81.3%～94.5%,与其他参考序列的同源性为81.8%～99.6%。遗传进化分析表明,4株云南流行毒株分为两个不同的进化分支,1株流行毒株和疫苗毒株同属于1.1基因亚型,其他3株流行毒株分布在另一进化分支上,属于2.1c基因亚型,研究结果为云南地区猪瘟的防控提供了一定的理论参考。     

河北省猪瘟病毒分子流行病学调查

为了研究河北省猪瘟病毒(CSFV)遗传变异规律,试验采用RT-PCR方法对河北省CSFV流行毒株E2基因进行扩增并测序,分析其遗传变异。结果表明:河北省CSFV流行毒株分为基因Ⅰ群和基因Ⅱ群,没有检测出基因Ⅲ群毒株。检测到3个基因型,其中起源于欧洲的2.1亚型已成为河北省的主要流行毒株,中国1.1亚型的传统毒株仍然存在,而20世纪80—90年代的基因2.2亚型和2.3亚型很少,有消失的趋势。核苷酸和氨基酸序列同源性分析显示,E2蛋白抗原表位氨基酸位点已发生变异,且疫苗株HCLV1900和流行毒株同源性较低,可能导致疫苗不完全保护。     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，均能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击。尤其是E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，同时还是研究CSFV抗原变异的主要区域。鉴于E2基因在CSFV感染、复制和免疫方面的重要作用，因此一直是猪瘟病毒研究的热点。     

2015年我国部分地区2.1d新基因亚型猪瘟病毒的分子流行病学分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)在我国的流行情况,本研究对2015上半年来自4个省疑似猪瘟(CSF)病料样品采用RT-PCR方法进行检测,28份样品中14份为CSFV阳性,并对这些阳性样品进行CSFV E2基因遗传进化分析。结果表明,14个病毒株中11个属于2.1d新基因亚型,它们与CSFV代表株Shimen、HCLV和2.1b基因亚型病毒株的核苷酸同源性分别为82.8%~84.1%、81.1%~82.4%和92.6%~97.1%,氨基酸同源性分别为89.8%~91.2%、88.2%~89.8%和94.1%~98.9%,其余3个病毒株属于2.1b亚型。这些2.1d亚型新分离株在E2基因的4个氨基酸(R31、S34、K303和A331)上具有相同的分子特征。本研究结果与我们2014年CSFV流行病学研究结果一致,表明2.1d亚型病毒株已成为我国现阶段CSFV的主要流行株。     

云南省野猪源猪瘟病毒E2及5'NTR基因序列测定分析

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重危害我国养猪业健康稳定发展。本研究采用RT-PCR方法,对从云南省宁洱县2头病死野猪体内分离到的2株CSFV毒株进行了E2及5''NTR基因扩增、克隆及序列测定;采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件,对测得的序列与国内外参考毒株进行了同源性分析及系统发育分析。结果显示：2株野猪源CSFV株E2、5''NTR基因同源性分别为87.2%、100%,与国内外参考毒株同源性分别为81.0%~97.6%、93.6%~98.5%,与我国强毒株Shimen株的同源性分别为81.0%~81.2%、95.6%;2株野猪源CSFV毒株E2基因属于基因2.1亚型,5''NTR基因属于基因2.3亚型。氨基酸序列分析显示：其中一株分离毒株的E2基因有6个氨基酸具有2.1d分子变异特征,另一株兼有2.1d和2.1b亚型分支特征,可能是2.1b和2.1d亚型的过渡毒株。结果表明,云南省野猪源CSFV虽存在一定的遗传衍化,但总体比较稳定。本研究为云南省CSF防控提供了分子流行病学依据,为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。     

我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异

采用 RT-PCR方法 ,从我国 1 0个省、市、自治区收集的 2 3个猪瘟病毒 ( CSFV)流行毒株中 ,扩增了CSFV E2基因中主要抗原位点编码区。对各扩增片段进行了序列测定 ,通过计算机分析构建了系统发生树 ,并确定了它们间的遗传相关性。结果表明 ,2 3个流行毒株中的 1 8株属基因 群 ,占 78.2 6%;另外 5个流行株与传统石门强毒、兔化弱毒株属基因 群 ,占 2 1 .74 %。两群间测序区的核酸同源性只有 78.90 %。此外 ,根据序列差异程度 ,将基因 群流行株分为 3个亚群 ,各基因群 CSFV在地域分布上未发现有明显的特征性。本研究初步揭示了我国较大范围内流行的 CSFV毒株与传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异 ,以及我国猪瘟病毒流行株在地域分布上的多样性     

猪瘟病毒山东惠民分离株E2基因的克隆及表达

从山东惠民某猪场病料中经RT-PCR扩增了猪瘟病毒（CSFV）E2基因,并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定,E2基因核苷酸序列长度为1 065bp,与GenBank中CSFV石门毒株（SHIMEN）、猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV）、猪瘟ZJ7分离株E2基因核苷酸序列同源性分别为85.1%,84.2%,98.8%;氨基酸序列同源性分别为91.5%,91.5%,98.6%。将E2基因插入到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG,获得重组质粒pKG-E2,再转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,受体菌能表达大小约为65 000的蛋白。Western blot显示表达的蛋白具有反应原性。     

猪瘟病毒一步法RTPCR检测方法的建立

 本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列,设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA,经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法,RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份,阳性检出率为92.3%;结果表明,建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析

为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%和82.2%~100.0%,与国内外分离株的核苷酸同源性为81.1%~98.9%,氨基酸同源性为79.8%~95.6%;遗传进化树分析表明,31株CSFV属于1.1和2.1亚群,其中23株为1.1亚型,8株为2.1b和2.1c亚群,没有发现2.2和2.3亚群毒株。氨基酸序列分析表明,流行株在免疫逃逸相关位点705,713,729和734位氨基酸发生变异,FJ02毒株B细胞表位关键位点771位氨基酸发生变异,表明福建地区CSFV流行毒株呈现遗传变异多样性。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达及Dot-ELISA建立研究

为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。     

猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

中国南方典型猪瘟病毒遗传多样性和猪瘟病毒毒株正选择分析

典型猪瘟病毒（CSFV）在世界范围内导致高度传染性疾病流行．给生猪产业造成巨大的经济损失。目前一直缺乏中国南方地区CSFV的准确的基因分型。这项研究对2008～2010年分离到的中国南方地区家猪不同毒株的E2基因进行分析（14株猪瘟病毒）。系统发育分析表明，     

可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中.     

猪瘟疫苗的“前世今生”

猪瘟病毒猪瘟病毒(CSFV)属于黄病毒科,是世界范围内最重要的猪病病毒。分子特性:单正股RNA,结构蛋白有衣壳蛋白(C)和3种囊膜糖蛋白(E0、E1、E2)。E0蛋白是唯一分泌到CSFV感染细胞血清中的糖蛋白,在机体内可诱导产生中和抗体;E2则是引起猪产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,在猪瘟诊断和新型疫苗的研究上都起着重要的作用。