鸡输卵管囊肿病病原的分离与鉴定

用病鸡的输卵管囊肿液中脱落的上皮细胞感染SPF鸡胚及BHK21、Vero、L929细胞,观察3～10d鸡胚死亡情况及细胞生长情况,并进行病原分离、鉴定、检测等.结果为SPF鸡胚感染后盲传15代,1～11代基本无鸡胚死亡,12～15代鸡胚有死亡.细胞感染后第1代可见到CPE,敏感性L929＞Vero＞BHK21细胞,被感染的细胞及卵黄膜(第4代起)CF呈阳性;电镜观察到胞浆中有衣原体;Giemsa染色光镜下可见包涵体颗粒;碘染色及磺胺嘧啶敏感试验均呈阴性;病毒学及细菌学检测阴性;雏鸡感染试验阳性;病鸡肝、脾、输卵管等组织病理变化明显.     

鸡输卵管囊肿病病原的分离与鉴定

用病鸡的输卵管囊肿液中脱落的上皮细胞感染SPF鸡胚及BHK21、Vero、L929细胞,观察3～10 d鸡胚死亡情况及细胞生长情况,并进行病原分离、鉴定、检测等.结果为SPF鸡胚感染后盲传15代,1～11代基本无鸡胚死亡,12～15代鸡胚有死亡.细胞感染后第1代可见到CPE,敏感性L929>Vero>BHK21细胞,被感染的细胞及卵黄膜(第4代起)CF呈阳性;电镜观察到胞浆中有衣原体;Giemsa染色光镜下可见包涵体颗粒;碘染色及磺胺嘧啶敏感试验均呈阴性;病毒学及细菌学检测阴性;雏鸡感染试验阳性;病鸡肝、脾、输卵管等组织病理变化明显.     

猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

从上海事某猪场发效仔猪体内分离到1株病毒，该毒株能在鸡胚成纤维细胞，RK，Vero,BHK21,ST,PK15细胞上增殖并产生细胞病变，通过蚀斑克隆对其进行纯化，克隆毒株在BHK21细胞上的TCID50为50μL10^-6.68稀释液，该病毒能被伪狂犬病毒（PRV）阳性血清中和，接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察可见直径110－180nm的典型疱疹病毒粒子，用该病毒接种兔仔猪均出现典型的伪狂犬病症状，表明该分离毒株为PRV。     

广西猪源H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

用SPF鸡胚从广西地区猪群中分离到1株H9N2型猪流感病毒(SIV),经鸡胚接种3代后出现稳定的鸡血红细胞凝集效价为27,且凝集性能被H9亚型阳性血清抑制,而不被其他亚型流感病毒阳性血清所抑制.分离株的HA基因及NA基因扩增结果显示,该毒株HA基因与流感病毒H9亚型同源性最高,NA基因与流感病毒N2亚型同源性最高,说明...     

人工感染BTV的绵羊血液中进行病毒分离的研究

为了指导蓝舌病(BT)研究中病毒分离工作,确定最佳病毒分离时间,比较鸡胚分离方法和BHK21分离方法的优缺点。本研究通过绵羊人工感染云南优势蓝舌病毒株BTV-1和BTV-16,采集不同时间的血液样品,用鸡胚和BHK21进行病毒分离。结果表明:用鸡胚的分离时间为接种后4~14 d,而BHK21细胞分离时间为2~8 d。本研究结果有助于BTV分离。     

肉鸡鹦鹉热衣原体病原微生物的实验室分离鉴定

目的:本研究对某肉鸡养殖场发生疑似鹦鹉热衣原体病的肉鸡群进行实验室诊断。方法:采集病鸡血清进行间接血凝试验做出初诊,将采集的病料组织接种于SPF鸡胚进行病原分离,通过特异性免疫荧光染色、姬姆萨染色观察包涵体进行鉴定。结果:血清学试验结果显示该肉鸡群感染衣原体发病率为25~30%,死亡率约为10%,病株在细菌培养基上不生长,SPF鸡胚盲传三代后4~6d鸡胚死亡,特异性免疫荧光染色,姬姆萨染色观察包涵体。结论:本研究通过血清学调查,细菌培养、病料接种SPF鸡胚进行病原分离,通过特异性免疫荧光染色,姬姆萨染色观察包涵体,初步判定该肉鸡场发病是由鹦鹉热衣原体感染所引起。     

鸭源禽腺病毒分离株的致病性及细胞培养特性研究

为进一步了解Ⅰ群禽腺病毒鸭源分离株的致病性和生物学特性,采取接种鸡胚和鸭胚,攻毒SPF鸡和雏鸭,并应用鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚肝细胞(CEL)培养观察细胞病变。试验结果表明,SPF鸡胚和鸭胚均出现死亡以及心包积液等典型症状,SPF鸡和雏鸭也引起不同程度死亡,且出现与临床送检病例类似的症状,PCR检测与序列分析证实分离的2株鸭源Ⅰ群禽腺病毒均为FadV-4血清型,病毒接种CEF细胞后没有细胞病变,而接种CEL细胞后则出现很强的聚集性、细胞变圆等典型病变。表明分离的鸭源FadV-4对SPF鸡和雏鸭均具有一定的致病性,对CEL细胞具有一定的适应性。     

安徽地区IBDV超强毒株的分离鉴定和VP2基因序列分析

经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种、易感鸡接种试验、电镜观察,从安徽地区疑似病鸡的法氏囊组织分离到3株传染性法氏囊病毒。分离株人工感染4周龄鸡,致死率分别为92%、83%、67%。接种9～10SPF鸡胚测得的鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-6.8/0.2mL、10-5.4/0.2mL、10-4.6/0.2mL。应用Nested-PCR分别对3株分离株VP2基因高变区进行克隆测序和序列分析,结果表明:3个分离株与国内外参考超强毒株的核苷酸同源性为97.2%～99.5%,氨基酸同源性为99.3%～100%,VP2高变区核苷酸和推导的氨基酸符合传染性法氏囊病病毒超强毒株特征。     

猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒 ,通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK -1 5细胞上连续传 1 2代均出现典型的细胞病变 ,用适应PK -1 5细胞的病毒接种Vero细胞、猪肾传代细胞IBRS -2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感 ,在pH5 0～ 9 0下稳定 ,5 6℃ 3 0分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板 ,应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒 1 2 40bp的gD基因的特异性片段。结果表明 ,所分离病毒为伪狂犬病病毒 ,并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒LA株。     

S2基因对IBV的细胞嗜性及生物学特性影响

为评估S2基因对传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的细胞嗜性及生物学特性的影响,本课题组前期将Vero细胞适应的Beaudette株S2基因重组到国内流行的QX型毒株r YX10 S2基因区域,构建了重组毒株r YX10-Beaudette-S2。在此基础上,本试验将重组毒株r YX10-Beaudette-S2和亲本毒株r YX10分别接种CK细胞和Vero细胞,培养不同时间后观察细胞病变、增殖效率及病毒含量情况,并分别接种鸡胚测定毒株对鸡胚致病力和鸡胚半数感染量。结果表明,r YX10-Beaudette-S2与r YX10在CK细胞上的增殖能力及对鸡胚的致病力无明显差异,r YX10-Beaudette-S2可在Vero细胞上快速复制,并在48 h达到病毒效价峰值,而r YX10在Vero细胞上不具备复制能力。研究表明:S2基因可影响IBV的细胞适应性,构建的重组毒株r YX10-Beaudette-S2可在Vero细胞中繁殖而对其本身的增殖效率和鸡胚致病力无显著影响。     

鹦鹉热嗜性衣原体感染SPF鸡和污染相关疫苗的初步调查

为初步调查SPF鸡感染鹦鹉热嗜性衣原体状况及相关SPF鸡胚源疫苗是否出现污染,本试验通过采集不同日龄的SPF鸡血清70份、SPF种蛋卵黄膜30份,收集市场上销售的SPF鸡胚源疫苗共41支,利用国产间接血凝试剂盒检测抗体,进口免疫荧光试剂盒分别测定其抗体、抗原阳性率,以评价SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体的流行状况和相关疫苗的污染状况。本试验结果显示,SPF鸡血清阳性率分别为31.4%(荧光法)、5.7%(间接血凝法);SPF种蛋阳性率33.3%,SPF鸡胚源疫苗平均阳性率31.7%。SPF鸡已经感染了鹦鹉热嗜性衣原体,且发现经鸡胚卵黄膜而传播病原的新途径,进而造成SPF鸡胚源疫苗出现衣原体污染。因此,加强SPF鸡鹦鹉热嗜性衣原体监测已势在必行。     

鸡痘病毒在哺乳细胞内复制的研究

将重组鸡痘病毒在1种禽类细胞和13种哺乳动物及人的细胞内培养.通过电镜观察可见重组鸡痘病毒在CEE、BHK、PK、BTC、Vero细胞内的复制,同时用PCR方法扩增出目的基因,Western-blotting检测到目的蛋白,验证是鸡痘病毒.试验表明鸡痘病毒在禽类、个别哺乳动物细胞中可以复制,但尚未发现在人的细胞内复制;在CEF中可以稳定传30代以上;在BHK内第1代可以观察到细胞病变(CPE);在PK、BTC、Vero内第2代可以观察到CPE,证明鸡痘病毒在个别哺乳动物细胞发生复制,但不能稳定遗传.     

鸡新城疫病毒分离株细胞培养特性的研究

该试验对实验室保存的已适应于鸡胚的鸡新城疫病毒(NDV)分离株进行了鸡胚成纤维细胞(CEF)和仓鼠肾传代细胞(BHK21)的接种传代,同时利用96孔微量多孔板培养BHK21细胞单层,并在其上测定NDV分离株的细胞半数感染量(TCID50)。结果表明：NDV分离株在CEF和BHK21细胞上引起典型的细胞病变,细胞变圆、聚集、脱落,残留的细胞呈拉网状结构。NDV分离株在BHK21细胞上的TCID50为0．02mL 10^-6.75稀释的病毒液。     

湖南省鸵鸟新城疫病毒的分离及生物学特性测定

湘南某鸵鸟养殖场饲养的鸵鸟发生一起疫病 ,疑似鸵鸟新城疫 ,为了准确迅速地对其进行确诊 ,用 SPF鸡胚进行病毒的分离 ,进行了HA、HI、病毒中和试验及生物学特性测定。结果最初接种的 SPF鸡胚 48～ 96h全部死亡 ,其尿囊液 HA效价为 2 3,死亡胚充血、出血 ,将尿囊液继续传代至第 3代时 ,死亡胚尿囊液 HA在收稿日期 :2 0 0 3- 0 4 - 0 9基金项目 :湖南省林业厅资助 (97- 2 4 )作者简介 :刘振湘 (1971- ) ,男 ,湖南耒阳人 ,湖南环境生物职业技术学院讲师。主要从事预防兽医学的教学与科研工作。2 5～ 2 6 ;其 ND HI试验为阳性 ;鸡胚中和试验结果接种经 ND标准阳性血清处理的病料未见死亡 ,HA效价为 2 0 ,而接种未经处理病料的鸡胚于 2 6～ 3 8h后全部死亡 ,HA效价为 2 6～ 7;其生物学特性测定结果 ICPI为 1 .62 ,IVPI为 1 .0 ,MDT为 45h,对氯仿和酸敏感 ,NHAT为慢 ,HOT为 1 5min。结果表明该分离毒为 NDV并表现出与鸡 NDV相同的特性。     

蛋鸡Ⅰ群腺病毒湖北株的分离与分子鉴定

从蛋鸡养殖场采集疑似"心包积水-肝炎综合症"蛋鸡的肝脏,分离病毒,处理后接种于SPF鸡胚。应用PCR方法扩增Ⅰ群腺病毒hexon基因并进行序列分析;将分离的病毒感染30日龄健康雏鸡,观察感染后鸡群临床症状和病死鸡病理变化。结果显示:分离的3株禽腺病毒病毒基因同源性为100%;与Ⅰ群腺病毒血清4型同源性为99.8%;与Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒同源性为43.1%~78.6%;病毒感染雏鸡后,第3 d出现鸡只死亡,第5 d达到死亡高峰期,整个试验阶段鸡只死亡率达到60%,解剖、死亡鸡可见典型心包积液-包涵体肝炎症状,肾细胞中出现空泡和坏死。结果表明,本研究成功分离1株Ⅰ群腺病毒,命名为Ⅰ群腺病毒湖北株。     

新城疫病毒山东流行株F基因的序列测定和分析

用 SPF鸡胚从发生新城疫鸡群分离到一株病毒 ,进行了生物学特性的研究 ,结果表明 ,最小致死量鸡胚平均死亡时间 (MDT)为 5 0 ,1日龄鸡脑内接种致病指数 (ICPI)为 1.82 ,6周龄鸡静脉接种致病指数 (IVPI)为 2 .6 2 ,属强毒力毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组 RNA,RT- PCR扩增其融合蛋白 F基因重要功能区片段 ,经回收后 ,克隆到 p GEM- T载体上进行酶切鉴定与核苷酸序列测定 ,并与多株已报道的 NDV国内外参考株相应片段进行序列比较 ,F基因的同源性在 84% - 91%之间 ,氨基酸同源性为 82 % - 93% ,经基因进化树分析 ,证实流行株为基因 型毒株     

肾型鸡传染性支气管炎病毒AH4-08株的分离鉴定

利用SPF鸡胚盲传,从自然发病、临床上表现为呼吸道症状、肾肿大、呈"花斑肾"的病死雏肉鸡的肾脏中分离到1株病毒。该病毒易感雏鸡,呈一过性呼吸症状,病死鸡肾脏肿大、苍白、呈花斑样;盲传至第五代,鸡胚呈现死亡和侏儒胚;分离株经过胰蛋白酶处理后能够凝集鸡的红细胞;同时,可干扰鸡新城疫病毒LaSota株在鸡胚上的增殖;电镜观察,可见大小80～120 nm、多呈球形、有囊膜的病毒颗粒,其表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。利用RT-PCR技术对分离株的N基因进行扩增,经序列测定和分析比较,证实分离株为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为AH4-08株。     

绵羊肺炎支原体人工感染SPF鸡胚的研究

为探索SPF鸡胚作为绵羊肺炎支原体实验室感染模型的可行性,本试验用不同浓度绵羊肺炎支原体（10⁸、10⁹、10¹⁰ ccu/mL）经由卵黄囊和尿囊腔两个部位接种7日龄SPF鸡胚,通过统计鸡胚死亡情况和不同鸡胚组织样品中绵羊肺炎支原体检测阳性率（PCR检测和支原体分离鉴定）,确定绵羊肺炎支原体鸡胚感染方式、感染剂量和最佳分离部位,再用3株不同来源的绵羊肺炎支原体分离株感染鸡胚,观察其对鸡胚的致病力。结果表明,绵羊肺炎支原体感染鸡胚最佳接种途径为卵黄囊接种,感染剂量为10⁹ ccu/mL、0.2 mL/只,最佳分离部位为卵黄液。3株支原体均能感染和致死鸡胚,并均能从卵黄液中分离到绵羊肺炎支原体,但对鸡胚的致病性存在一定差异：FL3株致鸡胚死亡率为45%,略高于MoGH3-3株（40%）,二者均高于A3株（25%）,但差异均不显著（P>0.05）;FL3株鸡胚检测阳率为100%,高于MoGH3-3株（85%）及A3株（90%）,但差异也不显著（P>0.05）。本试验初步确定了绵羊肺炎支原体可感染和致死SPF鸡胚,不同分离株对SPF鸡胚致病力有差异,表明SPF鸡胚可作为下一步建立绵羊肺炎支原体实验室感染模型的候选,为绵羊肺炎支原体致病性研究和疫苗研制奠定基础。     

鸡传染性法氏囊病毒JS株毒力测定

35日龄SPF鸡半数致死量(LD50)和9日龄SPF鸡胚半数致死量(ELD50)试验结果显示,传染性法氏囊病毒(1BDV)JS株的LD50为10-3.60.1 mL/只,ELD50为10-5.20.1 mL/胚;1～6周龄SPF鸡及商品鸡的致病性试验结果显示,IBDV JS株对SPF鸡和商品鸡3周龄后的致病率为100%,最高致死率分别为93.75%和75%;应用RT-PCR方法从IBDV JS株中扩增的VP2基因,经序列测定分析结果显示,IBDV JS株的VP2基因与香港HK46、日本OKYM、英国UK661等国际超强毒株的氨基酸序列的同源性达99%以上.表明IBDV JS株为超强毒株.     

云南省红河州猪衣原体性流产的病原分离鉴定

从母猪流产胎儿病料中分离到３株衣原体，将分离株鸡胚卵黄囊膜悬液接种７日龄鸡胚能致鸡胚规律性死亡；碘染色阴性；补体结合试验阳性；对鸡胚致死死毒价为１０^-9ＥＬＤ５０／０．４mL;该毒株能使小白鼠在３d内全部死亡。结果表明，该分离株为鹦鹉热衣原体；采用该场分离毒株,采用该场分离毒株制备的灭活苗免疫注射，母猪流产率由免疫前的３７．２１％下降到４．４２％，降低了３２．７９个百分点。