沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank提供的沙门菌invA基因序列和志贺菌ipaH基因序列设计引物,建立了二重PCR方法,在同一反应体系同时检测两种致病菌核酸,经二重PCR方法扩增后,在同一泳道同时检出沙门菌284 bp和志贺菌611 bp特异性扩增条带,而普通大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、阪畸大肠埃希菌、绿脓杆菌、蜡样芽胞杆菌、马链球菌、产单核细胞李斯特菌、鹅大肠埃希菌、猪水肿病大肠埃希菌均未出现这两种条带.对PCR产物进行测序,测序结果与已发表的基因核苷酸序列比较,沙门菌同源性为93%～100%,志贺菌同源性为98%～100%.应用建立的沙门菌和志贺菌二重PCR方法对广西6个试验猴养殖场1 665份猴粪便样品进行检测,检出沙门菌阳性25份,志贺菌阳性90份,阳性检出率分别为1.5%和5.4%.表明建立的沙门菌和志贺菌二重PCR检测方法特异性强、敏感性高,适用于临床粪便样品的快速检测.     

生鲜牛乳中产肠毒素大肠埃希菌环介导等温扩增技术的建立与应用

为了快速检测生鲜牛乳中的产肠毒素大肠埃希菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC),防止食源性产肠毒素大肠埃希菌给人类造成的危害,建立快速检测不耐热型产肠毒素大肠埃希菌的环介导等温扩增方法(LAMP)。敏感性和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,特异性强,能够从生鲜牛乳中检测到1pg产肠毒素大肠埃希菌DNA,与其他型大肠埃希菌及细菌不发生交叉反应。利用建立的LAMP技术对来自西宁市奶牛场及自由市场的21份生鲜牛乳样品进行检测,6份样品呈阳性,阳性检出率为28.6%,从分子水平为生鲜牛乳中产肠毒素大肠埃希菌的检测提供了一种快速、准确的手段,对保障生鲜牛乳的食品安全有重要意义。     

藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的分离与PCR鉴定

为研究外观健康藏系绵羊携带沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌情况,对采自外观健康藏系绵羊的19份肛门拭子进行大肠埃希菌和沙门菌分离鉴定.用选择性培养基及普通PCR方法共分离鉴定出1株沙门菌和13株大肠埃希菌,其中产志贺毒素大肠埃希菌4株,3株含有产志贺毒素基因Stx 1,1株含有产志贺毒素基因Stx 2,沙门菌invA基因和产志贺毒素大肠埃希菌Stx基因同源性分析表明,分离株沙门菌的invA与NCBI上已登录的5种血清型沙门菌核苷酸序列同源性为99.8％,4株产志贺毒素大肠埃希菌与NCBI上已登录菌株的核苷酸序列同源性都大于95％.本研究结果为高原地区藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的流行病学调查奠定了基础.     

毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。     

用四重PCR检测方法检测产单核细胞李斯特菌

为了同时快速准确的检测产单核细胞李斯特菌以及是否为有毒力的产单核细胞李斯特菌,根据相关文献报道的四重PCR方法,针对该菌的种特异性基因inl A基因进行引物设计,扩增片段大小为800bp,结果应用该PCR法可特异性的扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为97.3%。同时通过对毒力基因inlB,inlC和inlJ的检测用来判断菌株的相关毒力。而同一属的其他菌种无害李斯特菌(L.innocua),韦氏李斯特菌(L.welshimeri)均无特异条带,嗜水气单胞菌(J-1),产气荚膜梭菌(C57-13),大肠埃希菌(ATCC 25922),鼠伤寒沙门菌(C79-32),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)结果均为阴性。对临床上送检的23份样品进行四重PCR方法检测并同时与国家标准GB/T22429-2008食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,均检测出7份阳性样品。并且四重PCR法表明这7份阳性样品中的产单核细胞李斯特菌均携带有3种毒力因子(inlB,inlC和inlJ),因此该四重PCR法可用于快速鉴定是否是有毒力的产单核细胞李斯特菌,为有效预防控制产单核细胞李斯特菌污染提供技术支撑。     

奶牛犊牛腹泻源大肠埃希氏菌耐药情况及LEE相关基因的检测

为了明确宁夏地区奶牛犊牛腹泻源性大肠埃希氏菌的分离率、耐药情况和LEE毒力岛eaeA和ler基因的携带情况,采集宁夏5市16个规模化奶牛场1～2月龄犊牛病理性腹泻样本157份,采用微生物学方法培养、VITEK 2 Compact生化鉴定和PCR鉴定,应用PCR方法进行分离株LEE相关基因检测。结果分离鉴定到大肠埃希氏菌62株,对四环素耐药率为100%,对阿莫西林、氟苯尼考、哌拉西林等9种药物的耐药率大于90.00%,对阿米卡星较为敏感,耐药率为11.29%;LEE毒力岛eaeA基因的检出率为11.29%(7/62),ler基因的检出率为79.03%(49/62),二者同时检出率为3.23%(2/62)。结果表明,LEE的存在,可能是某些奶牛场犊牛腹泻大肠埃希氏菌病的原因之一,建议临床治疗犊牛腹泻大肠埃希氏菌病可以首选阿米卡星。     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。     

肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。     

沙门菌多重PCR检测方法的建立及其应用

为鉴定临床上常见的3种沙门菌血清型,针对特异性基因invA(沙门菌属)、sdfl(肠炎沙门菌)、Stm4495(鼠伤寒沙门菌)和SPUL-2693(鸡白痢沙门菌)设计引物,利用标准菌株通过优化体系成功建立了沙门菌的四重PCR检测方法.结果 显示:该方法特异性好,敏感性高(检测下限:基因组为500 pg/mL,菌液为10...     

鸡胚胎性病原茵多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏茵(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.aviun的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化.结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的茵发生反应.经优化B.aviun、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL.本研究建立的多重PCR方法为相关病原茵的快速检测提供方法.     

Rapid and specific differentiation of enterotoxin-producing Escherichia coli strains from other gram-negative enteric bacteria using multiplex PCR

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) may produce heat-labile (LT) and heat-stable (STI or STII) enterotoxins. Differentiation between ETEC and other pathogenic and non-pathogenic E. coli as well as other Gram-negative bacteria responsible for induction of diarrhoea, requires isolation, biochemical identification and determination of toxins (or their genes--elt, estI, estII). A multiplex polymerase chain reaction (PCR) system for the rapid and specific detection of enterotoxin-gene-positive E. coli was developed. The primers described by other authors, specific for the universal stress protein A (UspA) of E. coli and enterotoxin genes were used and allowed a simultaneous amplification of the E. coli-specific uspA and the respective toxin genes. The specificity of this multiplex PCR system was confirmed by testing ETEC, non-ETEC and other non-E. coli bacteria. The specific 884 bp uspA gene and 280 bp (eltI), 166 bp (estI) or 278 bp (estII) amplification products were generated with the respective ETEC strains whereas no amplification was detected with non-E. coli bacteria. The multiplex PCR developed allowed the rapid and specific identification of enterotoxin-producing E. coli colonies directly grown from faecal samples of pigs with diarrhoea. The test may be used as a method for the determination of ETEC among other pathogenic groups of E. coli and other Gram-negative enteric isolates.     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

多重荧光PCR检测水产品致病菌方法的建立与应用研究

根据沙门氏菌invA基因、副溶血性弧菌toxR基因和大肠杆菌O157：H7 RFBE基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度和特异性,建立了可同时检测上述三种致病菌的多重实时荧光PCR方法。该方法对纯茵的检测灵敏度均低于1O cfu／PCR反应体系。人工染菌样品经6h增菌,检测的灵敏度可低于10c...     

大肠杆菌菌毛基因多重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种可以同时扩增大肠杆菌(E.coli)F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因保守序列的多重PCR检测方法,本研究设计合成5对分别针对F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的特异性引物,以具有相应菌毛基因的E.coli参考菌株DNA为模板,通过对多重PCR反应条件的优化,建立了检测F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的多重PCR方法。所建立的多重PCR方法能够特异性扩增F4、F5、F6、F41、F18菌毛基因的目的片段,大小分别为770 bp、533 bp、422 bp、643 bp和1140 bp,该方法对沙门氏菌、猪丹毒杆菌、巴氏杆菌以及无菌毛基因的E.coli等参考菌株均无特异性扩增片段,检出F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最低活菌浓度分别为5.3×10^5cfu/mL、3.7×10^6cfu/mL、3.1×10^5cfu/mL、3.7×10^7cfu/mL、6.9×10^5cfu/mL。用不同批次的引物和试剂进行3次多重PCR检测均能扩增出目的条带,表明建立的多重PCR方法有很好的批内和批间重复性。对90株大肠杆菌临床分离菌株菌毛基因进行检测,F4阳性率为3.33%,F5阳性率为2.22%,未检测到F6、F41和F18阳性菌株,其检测结果与常规单一PCR的检测结果一致。研究表明:建立的E.coli菌毛基因多重PCR分型方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,可用于E.coli分离菌株菌毛基因型的快速鉴定,同时提高了检测效率。     

腹泻仔猪肠道致病性大肠埃希氏菌和沙门氏菌的分离鉴定与耐药性研究

为探明仔猪细菌性腹泻肠道致病性大肠埃希氏菌和沙门氏菌流行的血清型、耐药表型及耐药基因型,本试验采集了贵州省5个地（州）市7个规模化养猪场的128份腹泻仔猪肠道样本,并对采集的样本进行了大肠埃希氏菌和沙门氏菌分离与鉴定,通过动物试验鉴定菌株的致病性,利用血清学方法鉴定其血清型,并通过药敏纸片法对主要致病菌进行耐药性研究,采用PCR技术检测各致病菌株耐药相关基因,分析细菌耐药表型和耐药基因型相关性。结果显示,本研究共分离鉴定到78株致病性大肠埃希氏菌与21株沙门氏菌,致病性大肠埃希氏菌血清型以O138、O87为主,沙门氏菌血清型以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌居多;药敏试验结果表明,本试验分离到的78株致病性大肠埃希氏菌对β-内酰胺类药物耐药率达80%以上,对其他种类的抗菌药耐药率均超过40%,分离鉴定的21株沙门氏菌对氨基糖苷类药物耐药率达50%以上,对其他种类的抗菌药耐药率均达20%以上;本试验分离鉴定的致病性大肠埃希氏菌共检出12种耐药相关基因,沙门氏菌共检出10种耐药相关基因,两种细菌耐药基因型与耐药表型符合率均达60%以上,且均为多重耐药。本研究为仔猪腹泻的综合防控提供了理论依据。     

Isolation,Identification and Drug Resistance Analysis of Interstinal Pathogenic Escherichia coli and Salmonella Isolated from Diarrhea Piglets

In order to find out the serotype, resistant phenotype and genotype of Escherichia coli (E. coli) and Salmonella in piglets, this study collected 128 samples of diarrhea piglets from seven large-scale pig farms in five cities in Guizhou province, and the E. coli and Salmonella were isolated and identified. The pathogenicity of the strain was identified by animal test. The drug resistance of the main pathogen was tested by drug susceptibility paper. The resistance gene of each pathogen was detected by PCR. The drug resistance and genotype correlation of the bacterial were analyzed. The results showed that 78 strains of pathogenic E. coli and 21 strains of Salmonella were isolated and identified in this study. The serotypes of pathogenic E. coli were predominantly O138 and O87. Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis were predominant serotypes. The susceptibility test showed that the resistant strains of 78 strains of E. coli were more than 80% resistant to β-lactams and more than 40% for other antibacterials. The resistance rate of 21 strains of Salmonella to aminoglycosides was more than 50% and more than 20% to other types of antibacterials; 12 and 10 kinds of drug resistance-related genes of E. coli and Salmonella were detected, respectively; The coincidence rate of resistant genotype and phenotype of two kinds of bacteria were above 60%, and both were multiple drug resistance. This study provided a theoretical basis for comprehensive prevention and control of piglets diarrhea.     

多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用

建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌（Streptococcus suis）的多重荧光PCR（multiplex real-time polymerase chain reaction）方法。首先，从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp，用PrimerExpress2．0设计引物和Taqman荧光探针，在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性；检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量，整个过程仅需60min；稳定性试验表明，2次检测所得的ct值之间无统计学差异（P〉0．05）。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强，灵敏度高，稳定性好，适合于大批量样品的检验，可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

三种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立

根据沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的保守基因序列,设计特异性引物和以不同荧光素标记的探针。通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了检测沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的三重荧光PCR检测方法。为了评价所建立的实时PCR检测体系的特异性,试验中选取了阳性菌株及干扰菌株进行特异性验证。同时对梯度稀释的纯化DNA和不同浓度引物探针进行检测以确定方法的灵敏度。结果表明,该方法有效、特异、敏感、稳定,对于动物产品中沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的快速检测具有重要应用价值。