应用23S rRNA对禽波氏杆菌分离株的进化分析

通过PCR扩增分离保存的8株禽波氏杆菌、3株兔支气管败血波氏杆菌及1株猪支气管败血波氏杆菌菌株的23S rRNA基因的片段(710bp),分别克隆到载体pMD18-T后测序。利用BLAST工具进行同源性搜索;用DNAStar分析软件进行同源核苷酸序列的多重比较分析并构建禽波氏杆菌菌株的系统生物进化树。结果显示,8株禽波氏杆菌核苷酸序列之间同源性为99.2%～99.7%,与GenBank中收录的NC_010645株禽波氏杆菌核苷酸序列同源性为92.4%～92.5%,与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的核苷酸序列同源性均为98.5%～99.2%。国内分离的禽波氏杆菌菌株和支气管败血波氏杆菌菌株均与国外分离菌株在遗传基因上有一定的差异。结果表明,23S rRNA序列分析可以作为鉴定禽波氏杆菌的一种快速简便的方法。     

禽波氏杆菌外膜蛋白A的克隆测序与生物信息分析

本文旨在克隆禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA的编码基因,并预测OmpA蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨禽波氏杆菌外膜蛋白OmpA在免疫保护中所起的作用。作者对禽波氏杆菌的外膜蛋白ompA基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对禽波氏杆菌OmpA蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。禽波氏杆菌ompA基因全长597bp,编码199个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和β-片层,少见β-转角;推测OmpA蛋白有5个B细胞优势抗原表位区域、2个糖基化位点。本研究为进一步分析禽波氏杆菌免疫机理、制备单克隆抗体和设计表位疫苗等奠定理论基础。     

芦荟粗提物抑菌及抗病毒作用的研究

为研究芦荟粗提物对多种常见畜禽致病菌和病毒的体外抑菌和抗病毒作用,本实验采用培养基打孔法观察芦荟粗提物对致病菌的抑茵作用;采用含不同浓度芦荟粗提物的固体培养基培养致病菌观察其抑茵效果;采用细菌计数法分析致病茵在芦荟粗提物液体培养基中的增殖情况.分别采用细胞培养和鸡胚接种法检测不同浓度芦荟粗提物以及不同作用时间对传染性囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)增殖的抑制作用.结果表明:芦荟粗提物对供试茵均具有抑茵作用,其中金黄色葡萄球菌、四联球菌、八叠球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌培养时出现明显的抑茵圈,直径(D)＞14 mm;固体培养基中芦荟粗提物浓度大于40％时可形成可明显地减少茵落数;浓度大于80％的液体培养基中细菌生长到达对数期的时间比对照组延长至少4h.IBDV与芦荟粗提物作用组的MTT OD570nm值均高于病毒对照组,并且随浓度的增大和时间的延长而升高;NDV与芦荟粗提物作用组的血凝价均低于病毒对照组,并且随浓度的增大和作用时间的延长而降低.     

鸡胚胎性病原茵多重PCR检测方法的建立

为建立同时检测禽波氏杆菌(Bordetella avium)、沙门氏茵(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)4种导致鸡胚死亡病原菌的多重PCR方法,本研究根据B.aviun的ompA基因、Salmonella的invA基因、E.coli的phoA基因和P.aeruginosa的toxR基因序列,各设计一对特异性引物进行多重PCR反应,并对反应体系和条件进行优化.结果显示,4对引物分别扩增出597bp、724bp、372bp和278bp的目的条带;并且特异性强不与其他非目的茵发生反应.经优化B.aviun、P.aeruginosa和E.coli多重PCR检测灵敏度达到104cfu/mL,而Salmonella为103cfu/mL.本研究建立的多重PCR方法为相关病原茵的快速检测提供方法.     

多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用

 【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因（invA）和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的 hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌所设计的3对引物分别能扩增出374、724和215 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,3种目的菌在105 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带(奇异变形杆菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌在104 CFU/mL浓度下仍然可见到条带),比单基因PCR低一个稀释度,并且人工模拟试验和市售食品试验检测结果稳定。【结论】该方法操作简单、快速、特异性强和灵敏度高,能够实现对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的快速诊断检测和监控。     

奇异变形杆菌分离株23S rRNA序列分析

通过PCR反应扩增7株鸡奇异变形杆菌和1株兔奇异变形杆菌的23SrRNA基因片段(1045bp),经克隆测序,用DNA Star分析软件将所获得的序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌、普通变形杆菌以及其他相近属的23S rRNA基因序列进行同源性比较,并由此构建奇异变形杆菌系统进化发生树。结果表示,本实验室保存的7株鸡奇异变形杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与兔奇异变形杆菌核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,与普通变形杆菌的核苷酸序列同源性为95.4%～96.2%,而与其他相近属同源性只有92.9%～93.4%。结果表明,23S rRNA基因序列分析可以作为鉴定奇异变形杆菌的一种快速、简便的方法。     

泰山松花粉多糖对小鼠免疫增强作用的研究

【目的】研究泰山松花粉多糖对健康小鼠免疫功能的增强作用以及对免疫抑制小鼠的免疫恢复作用。【方法】用改进的水提醇沉法提取泰山松花粉粗多糖。取清洁级昆明小鼠(雌性)160只,随机分为8组,3个多糖组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),3个环磷酰胺(Cytoxan,CTX)-多糖组(Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ),另外2组为CTX对照组(Ⅶ)和正常对照组(Ⅷ)。Ⅰ、Ⅳ组多糖注射剂量为400mg·kg-1,Ⅱ、V组多糖注射剂量为200mg·kg-1,Ⅲ、Ⅵ组多糖注射剂量为100mg·kg-1,从第1天连续皮下注射7d;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ组于第1天每只每次腹腔注射75mg·kg-1CTX,隔1天注射一次,共计3次;Ⅷ组皮下注射生理盐水。第8天,所有小鼠腹腔注射1头羽份的ND冻干苗,分别在免疫后3、10和15d采取血液、脾脏和小肠,用β微量法检测血清抗体、全自动血细胞分析仪测定外周血淋巴细胞比率、流式细胞术检测脾淋巴细胞转化率,ELISA法检测小肠IgA含量。【结果】Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组各指标均显著高于Ⅷ组(P0.05),其中Ⅰ、Ⅱ组与Ⅷ组相比差异极显著(P0.01)。Ⅳ、Ⅴ组极显著高于Ⅶ组(P0.01),Ⅵ组显著高于Ⅶ组(P0.05),Ⅳ组结果与Ⅷ组差异不显著。并且免疫后10d的各组显著高于免疫后3d的各对应组(P0.05),与免疫后15d的差异不显著。【结论】泰山松花粉多糖能提高正常小鼠和免疫抑制小鼠的抗体水平、血液淋巴细胞比率、脾脏淋巴细胞转化率以及小肠IgA含量,200mg·kg-1剂量的效果即非常显著,400mg·kg-1剂量能使CTX诱导的免疫抑制完全恢复到正常水平。     

鸡奇异变形杆菌外膜蛋白的抗血清制备及其荧光标记抗体检测方法的建立

为建立鸡奇异变形杆菌(P.mirabilis)直接荧光标记抗体检测方法,本研究提取P.mirabilis外膜蛋白(OMP),以OMP免疫健康新西兰家兔制备兔抗鸡P.mirabilis OMP高免血清,纯化的IgG,用FITC标记得到兔抗鸡P.mirabilis OMP-IgG的荧光标记抗体,建立直接荧光标记抗体检测方法。应用该方法检测临床样品184份,检测结果与细菌分离法和微量平板凝集比较,结果表明提取的OMP含有6种成分,分子量分别为67.0ku、63.1ku、57.5ku、53.7ku、43.0ku和31.6ku,经过优化的OMP-IgG荧光标记抗体最佳工作浓度为0.25mg/mL,最佳感作时间为30min。临床检测结果显示该方法具有简便、快速、敏感和特异性强等优点,为鸡P.mirabilis病的流行病学调查和临床快速诊断提供了技术保障。     

超强毒IBDV GX8/99株4株克隆化毒F20代免疫效果分析

本研究将以vvIBDV GX8/99株4株克隆化细胞毒为研究对象,通过鸡胚成纤维细胞连传至20代,得到4株克隆化毒F20代:GX-IBDVE10 C25 CL1-20、GX-IBDVE10 C25 CL2-20、GX-IBDVE10 C25 CL4-20、GX-IBDVE10 C25CL5-20.分别提取RNA,通过Nested-PCR、基因克隆、核苷酸序列测定和分析,从而摸索出了vvIBDV GX8/99株四株克隆株在细胞传代过程中VP2核苷酸序列和推导出的氨基酸序列的变化规律.与原始囊毒和D78疫苗毒相比,4个细胞适应毒克隆株F20 VP2高变区的约145个氨基酸中,有12个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致.实验表明VP2高变区大多数氨基酸的变异与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切.将4株克隆毒株的20代细胞毒免疫SPF鸡,40日龄进行攻毒实验,免疫效果明显,保护率几乎达到100％,二免后第14 d左右抗体浓度达到高峰.从抗体水平和病理组织学变化看,4株克隆化毒F20代中GX-IBDVE10C25CL4-20株免疫效果稳定,病理变化不明显,有望成为理想的疫苗株,为控制vvIBDV的感染提供一条新的途径.     

AA肉种鸡内源性类ALV-J gp85基因及其抗原表位的分析

利用ALV-J gp85基因两侧的序列片段为引物,从山东潍坊某肉种鸡场送检的7日龄肉种鸡基因组中完整地扩增了内源性类ALV-J gp85基因。利用ALV-J env基因特异性引物不能扩增出长度为2.2kb的目的片段,用ALV-J特异性单抗JE-9做间接免疫荧光检测,也呈现阴性反应。这种内源性类ALV-J gp85基因与已报道的禽内源性反录病毒EAV-HP序列的同源性为85.6%～93.8%,其中与ADOL 0系来航鸡EAV-HP的相似性最高(93.8%)。所得到的内源性类ALV-J gp85基因与外源性ALV-J毒株HPRS-103、SD07LK1、NX0101的同源性分别为93.8%、91.8%和91.7%。并且与外源性ALV-J gp85基因具有相似的Jameson-Worlf抗原表位优势。这种内源性类gp85基因很可能与肉雏鸡早期感染ALV-J后所呈现的免疫耐受现象有关。