多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用

建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌（Streptococcus suis）的多重荧光PCR（multiplex real-time polymerase chain reaction）方法。首先，从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp，用PrimerExpress2．0设计引物和Taqman荧光探针，在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性；检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量，整个过程仅需60min；稳定性试验表明，2次检测所得的ct值之间无统计学差异（P〉0．05）。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强，灵敏度高，稳定性好，适合于大批量样品的检验，可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立

建立了一种检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2)的实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)方法。用Primer Express2.0和Oligo6.0设计针对Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原基因簇中cps2I基因的引物和Taqman荧光探针。通过常规PCR方法扩增得到81 bp DNA片段，克隆到pMD18-T载体，测序表明得到的序列为目的基因片段。在Lightcycler荧光PCR仪上对Ⅱ型猪链球菌的扩增曲线表明，该实时荧光PCR具有良好的特异性，可成功地扩增Ⅱ型猪链球菌，而参考猪链球菌(S.suis)、大肠杆菌(Escherichia coli )、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、志贺氏菌(Shigella)、单增李斯特氏菌(Listeria monocytoge)和空白对照都是阴性；该检测方法可达到检测10个细菌的灵敏度，反应过程仅需30 min完成；在两个不同时间检测同一浓度的菌液，每次做20个重复，2次检测所得的Ct (threshold，阈循环)值之间无统计学差异(P > 0.05)，方法稳定性好。该实时荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法可用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。