实时荧光定量PCR法检测转基因猪外源基因整合拷贝数

以GFP转基因猪为研究对象,以转铁蛋白受体基因为内参基因,通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR建立针对外源基因GFP和内参基因的双标准曲线和方程。对转基因猪基因组DNA中外源基因和内参基因的拷贝数同时定量检测,外源基因与内参基因起始模板拷贝数的比值即为外源基因在转基因猪中的整合拷贝数。同时,利用Southern-blot进行验证分析。结果显示:实时荧光定量PCR法检测2头转基因阳性猪外源基因拷贝数分别为3和2,2头转基因阴性猪外源基因拷贝数均为0,结果同Southern-blot检测一致。结果表明:实时荧光定量PCR法高通量、灵敏、方便,可以更好的用于转基因猪外源基因整合拷贝数的检测。     

精子介导法制备GHRH转基因猪的研究

以eGFP为报告基因,生长激素释放激素(GHRH)为目的基因,利用精子介导的基因转移方法,将构建慢病毒载体质粒LV-EGFP-GHRH直接和猪精子孵育,再通过体外人工受精建立GHRH转基因猪模型.经PCR检 测,52头后代中发现7头阳性个体,转基因效率为7.42%.本研究探索了应用精子介导的转基因方法将GHRH转移到动物体内,为猪的转基因育种提供了新的依据.     

原核注射法转基因猪外源基因整合位点的分布及其遗传规律

应用非同位素标记染色体原位杂交技术，对9头不同世代的转OMT－PGH帮6头原代转hDAF基因猪外源基因整合位点的分布及其遗传规律进行了研究。结果表明，4头原代转OMT－PGH基因猪外源基因分别整合在第7，13，2和8号染色体上，6头原代转hDAF基因猪外源基因分别整合在第13，6，11，2，7和7号染色体上，证实了用原核注射法转基因猪外源基因的整合是“随机”的，来自同一亲本，不同世代的5头转OMT－PGH基因猪，其外源基因均存在于第13号染色体上，与共同祖先原代转基因猪的整合位点相一致，表明转基因猪外源基因可以传递给后代，且整合位点的遗传是相对稳定的。     

禽类转基因生产及其应用的研究现状和进展

1.7 精子载体转基因法（Sperm mediated gene transfer) 1.7.1 辐射精子作载体法 Pandoy和Patchell用致死剂量辐射带有选择标记的鸡精液进行授精（制造假妊娠），然后再用同种精液进行正常受精，以此来进行品种标记基因的转导。该试验以羽色和蛋壳色基因为标记，用此法在后代中获得3.5%的后代可表达外源基因。这种方法可以准确地使DNA进入核内，同时解决分离、提供插入所需基因的困难，但是无特异性，遗传频率不能预知，而且会导入不需要的基因。Bumstead［6］从对马立克氏病敏感和淋巴白血病抗性的母鸡得到转基因鸡，发现这种转基因鸡蛋对两种疾病都表现敏感而不表现抗性。这一实验直接证实了辐射精子发生非特异性整合的事实。 1.7.2 精子载体法 在禽类中精子载体转基因法能够在子代中获得1/300的携带外源基因个体。1990年法国国立发育生物学研究所的以色列研究者用此法导入外源基因，用Southern杂交法检测出阳性个体。但是至今未能获得F1代。Gruenbaum等以LacZ和CAT作为标记基因，用吸附该基因的鸡精子进行人工授精，对获得的胚胎及雏鸡进行Southern杂交和PCR分析，结果在所检测样本中30%～60%整合有外源DNA，在部分组织中检测到外源基因表达产物，在传代试验中，证明外源DNA能遗传给后代。Squries等根据精细膜的特性和相似相溶原理，用脂质体包装外源DNA与精子共同孵育，然后进行人工授精，在鸡上获得成功，阳性率为15%～25%。     

跨膜蛋白66生物信息学分析及其突变体转基因小鼠构建

跨膜蛋白66(TMEM66)是与细胞凋亡以及癌症发生密切相关的重要功能基因,为了在个体水平研究其生物学功能,我们进行了TMEM66基因突变体(TMEM66V)转基因小鼠的构建。本研究通过原核注射法进行转基因操作,将获得的312个受精卵移植到13只代孕母鼠中,运用PCR、Southern blotting对出生的小鼠进行转基因鉴定,对于转基因阳性小鼠通过传代试验研究外源基因是否稳定整合,并通过反向PCR方法研究外源基因的整合方式。结果显示在出生的55只小鼠中有6只为转基因阳性,其中3只转基因小鼠可以稳定传代,表明这些小鼠中外源基因发生了稳定整合。反向PCR检测结果发现外源片段是以串联重复的方式整合到转基因小鼠的基因组中。本研究成功构建了TMEM66基因突变体转基因小鼠,为进一步研究TMEM66基因的功能奠定了基础。     

转外源基因(pGH)在猪染色体上整合状况

应用地高辛标记技术,对通过睾丸注射法制备的转基因猪进行荧光原位杂交,确定外源pGH(猪生长激素)基因在染色体上的整合位点及数目.选用睾丸注射法制备的140日龄转基因长白猪6头与同期同龄非转基因猪2头进行血细胞培养及荧光原位杂交.结果显示,外源基因已整合于染色体上,但在染色体上的整合位点具有随机性,而且不同的转基因猪阳性个体外源基因在染色体上的整合位点有差异,但集中分布于1、6、8、13号染色体上;非转基因猪染色体上无杂交信号;个体杂交信号数越多,其生长速度越快.     

家蚕精子介导转基因技术体系的优化

为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。     

猪基因导入研究中两种转基因方法的比较

供试受体母猪共87头,其中50头受体母猪用显微注射法获得转基因卵。37头受体母猪采用精子载体法通过人工手术输精使其受孕。其受胎率前者为63.24％,后者为30.87％;平均产仔数分别为5.38和6.18头;基因整合阳性率分别为17.9％和12.7％;转基因效率分别为2.7％和2.8％。两种方法,平均产仔数.基因整合阳性率及转基因效率之间差异不显著(P>0.05),而受胎率之间差异极显著(P<0.01)。用精子载体法导入外源基因,不需对胚胎进行体外显微操作,大大简化了生产转基因动物的程序.但此方法尚需逐步完善。     

精子载体法转基因技术研究进展

精子载体法是以精子作为外源基因的载体,在受精过程中将外源基因导入动物胚胎,从而使外源基因进入子代的基因组中。作者就精子结合外源基因的机制,精子与外源基因结合的方法、影响精子转染外源基因和生产转基因动物的精子因素进行简要介绍,并对发展起来的输精管内注射转染法、曲细精管微注射法和睾丸直接注射法等精子载体转基因新途径进行综述。     

睾丸注射Mx-NA双基因制备抗病转基因鸡的研究

本研究利用精原干细胞介导法体内转染重组载体pVITRO2-Mx-NA以生产抗病转基因鸡。采用睾丸注射法将脂质体包裹的线性化质粒通过随机打点注射入公鸡睾丸,采集25、50、60、70d后试验公鸡的精液,提取基因组DNA,采用常规PCR检测外源Mx-NA联合基因的整合;转染后60d采集阳性公鸡精液人工授精母鸡,采用PCR和Western blot方法检测后代血液中外源NA-Mx联合基因的表达情况。结果表明:PCR检测证实外源Mx-NA联合基因已在精子基因组中表达,精液PCR阳性率为33.33%(2/6),且能通过体外受精在后代中检测到,后代PCR检测的阳性率为31.43%(11∕35),Western blot检测F1代阳性率为28.6%(10/35)。以上结果证明外源Mx-NA基因能稳定整合到鸡的基因组中,表明睾丸注射法是一种操作简单、有效的制备抗病转基因鸡的方法。     

含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒的构建

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入转移载体质粒pPI-2．EGFP中，构建了含PPV VP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失表达载体质粒pPI-2．EGFP．VP2。采用磷酸钙转染系统，将pPI-2．EGFP．VP2 DNA和PRV DNA共转染Vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-blot核酸杂交筛选得到几株重组病毒，将其中一株（命名为SA215-B）DNA用BamHI酶切和Southern转印杂交进一步验证重组病毒构建成功，并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约93ku的融合蛋白，同时融合蛋白中的PPV VP2结构蛋白仍然保持了原有的反应原性，表明成功构建了含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病-伪狂犬病重组病毒。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。     

猪肌生成抑制素基因的克隆和序列测定

根据文献报道的猪肌生成抑制素基因cDNA序列，分别从第1、第2和第3外显子中设计引物，以大约克猪染色体DNA为模板，分段扩增出含内含子和外显子的序列。将所得各序列回收、克隆到pGEM-easyT载体中，然后进行序列测定。合并所有测得的猪肌生成抑制素因序列，共获得6kb连续序列。分析结果表明，猪肌生成抑制素基因第1内含子长1809bp，第2外显子长374bp，第2内含子长1978bp。所测得的外显子序列与已发表的cDNA序列同源分析比较，没有出现引起氨基酸改变的突变。表明瘦肉型猪（大约克猪）肌生成抑制素基因仍很完整，可通过改变基因结构等降低肌生成抑制素活性的方法提高瘦肉率。     

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of LpxB Gene of Brucella melitensis

The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively.     

羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。     

Cloning and Bioinformatics Analysis of L2R Gene of Sheeppox Virus GY Strain

To explore the molecular characteristics of protein L2R from sheeppox virus(SPPV), genomic DNA was extracted from SPPV GY strain. The specific primers were designed and used to amplify the L2R gene from the genomic DNA by PCR. Then the PCR product was ligated into pGEM-T Easy vector. After transformation into E. coli Trans 5α, the positive clones were sequenced and the sequences were analyzed by the bioinformatic softwares. The result showed that L2R gene sequence contained an open reading frame (ORF) of 279 nucleotides and deduced protein consisted of 92 amino acids with the theoretical molecular weight of 10.92 ku and isoelectric point was 6.56. Analysis of secondary structure of protein L2R revealed that α-helix, β-strand, random coil and extended strand were 69.57%,9.78%,8.70% and 11.96%,respectively. Analysis of multiple sequence alignment showed that L2R gene from different capripox virus isolates were highly conserved, phylogenetic analysis showed that GY and NK, TU and SA was in a branch, indicating with a close genetic relationship among them. The present results laid a foundation for further studies of biological functions of protein L2R and interaction among the early proteins of capripox virus.     

绵羊痘病毒固原株L2R基因的克隆与生物信息学分析

为分析绵羊痘病毒L2R蛋白的分子特征,本试验提取了绵羊痘病毒固原株（GY）的基因组DNA,设计L2R基因引物,对L2R基因进行扩增,将扩增的基因连接到pGEM-T Easy载体后转化到大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行序列测序。利用生物信息学软件对L2R基因序列进行预测分析。结果显示,L2R基因序列含有一个由279个核苷酸组成的开放阅读框,编码92个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为10.92 ku,理论等电点为6.56。该蛋白质二级结构组成分别是α-螺旋占69.57%,β-折叠占9.78%,无规则卷曲占8.70%,延伸链占11.96%。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株L2R序列高度保守。进化树分析结果显示,GY株与NK、TU及SA株在一个分支,表明它们之间亲缘关系较近。本试验结果为进一步研究L2R蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响

为了研究山羊痘病毒TK基因功能缺失对其增殖的影响,同源重组构建TK基因缺失型重组山羊痘病毒,检测其增殖特性。试验在通用转移质粒pTKfpgigp内插入不同长度的X1~X4片段,构建了4个重组转移质粒;重组质粒转染已感染山羊痘病毒的羔羊睾丸细胞,经同源重组产生4株TK基因缺失型重组山羊痘病毒rGPV/tk^－,其TK基因内分别插入了长度约为2 800、4 000、5 200、7 700 bp的外源DNA片段;筛选纯化重组毒株,测定rGPV/tk^－病毒滴度。结果显示,TK基因失活后,rGPV/tk^－病毒滴度明显降低;随着插入DNA片段的延长,重组毒株的病毒滴度下降程度更加明显。研究表明,TK基因功能的缺失对山羊痘病毒的增殖具有一定的抑制作用,并与外源DNA的长度具有相关性。     

小肠结肠耶氏菌毒性质粒基因文库的构建

本研究以pAT153质粒为载体,构建了小肠结肠耶氏菌毒性质粒(pVYE)经限制性内切酶Bam HI和PstI消化产生的DNA片段的基因文库.实验克隆了8株(pYBI～8)pVYE的BamHI片段和6株(pYPI～6)pVYE的PstI片段的重组子.其中pYB4、pYB7、pYB8重组质粒中插入的pVYE—Bam HIDNA片段的分子量分别为8.7、3.8、20kb;pYP3、pYP5、pYP6重组质粒中插入的pVYE-Pst I DNA片段的分子量分别为4.5、3.0、7.0kb.本实验结果为进一步筛选和制备特异性基因探针奠定了基础.