伏马毒素B_1适配体的筛选及其快速定量检测方法的建立

本研究旨在获得伏马毒素B1特异性适配体并利用其和胶体金的作用建立伏马毒素B1的快速检测方法。通过非固定靶标的指数富集配体系统进化技术筛选获得伏马毒素B1的适配体,并用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定所获适配体的亲和力和特异性,建立基于适配体的胶体金快速定量检测方法。结果表明:筛选得到的伏马毒素B1适配体F102亲和力解离常数为(42.1±4.0)nmol/L;建立的胶体金检测方法简便、快速、特异性强;样品检测结果与液相色谱结果的相对误差低于15.7%。因此,本研究利用筛选得到的适配体建立了可用于谷物和饲料中伏马毒素B1含量的快速定量检测方法。     

黄曲霉毒素B_1胶体金快速定量检测试剂盒的研发

本研究旨在应用胶体金免疫层析技术,结合胶体金定量读数仪研制出一种快速定量检测谷物和饲料中黄曲霉毒素B_1含量的胶体金快速定量检测试剂盒。该试剂盒以胶体金标记高特异性单抗,与偶联抗原进行正交试验,确定适宜条件,同时通过与对照线和试验线的颜色对比,应用胶体金定量读数仪,对样本中黄曲霉毒素B_1含量进行定量检测。结果表明,黄曲霉毒素B1胶体金快速定量检测试剂盒检测方法简便、快速、稳定性好,且可得出具体数据,避免了人肉眼观察的差异;与常见霉菌毒素无交叉反应,样品检测结果与高效液相色谱法检测结果的相对误差在20%以内。由此可见,本试验研制的黄曲霉毒素B_1胶体金快速定量检测试剂盒可用于谷物和饲料中黄曲霉毒素B_1含量的快速定量检测。     

核酸适配体比色法检测恩诺沙星

(目的)研究检测恩诺沙星的胶体金核酸适配体比色法,(方法)将恩诺沙星核酸适配体与胶体金结合后形成胶体金适配体复合物,然后加入恩诺沙星靶标分子,由于核酸适配体与靶标的高效特异性结合,核酸适配体与胶体金解离.最后加入NaCl后,胶体金由红变兰.(结果)胶体金比色检测体系中,NaCl的最佳浓度为1M,核酸适配体的最佳浓度为2μM.对恩诺沙星的比色检测限为15ng/mL.(结论)基于胶体金和核酸适配体的比色法可用于恩诺沙星的快速筛选.     

胶体金核酸适配体比色法检测氨苄西林钠的研究

为了研究检测氨苄西林钠的胶体金核酸适配体比色法,试验采用纳米金为载体,将核酸适配体与其结合后形成胶体金适配体复合物,然后加入靶标分子,由于核酸适配体与靶标的高效特异性结合,核酸适配体与胶体金解离,加入Na Cl后胶体金由红色变为蓝色。结果表明:胶体金比色检测体系中,Na Cl的最佳浓度为1 mol/L,核酸适配体的最佳浓度为2μmol/L。对氨苄西林钠的比色检测限为3.12 ng/mL。说明基于胶体金和核酸适配体的比色法灵敏度较高,可用于氨苄西林钠的快速筛选。     

猫细小病毒适配体的筛选与鉴定

为筛选猫细小病毒(FPV)特异性核酸适配体,本研究利用体外指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从80 nt的单链DNA随机文库中筛选出与FPV高亲和力、高特异性结合的核酸适配体。对FPV适配体共进行14轮筛选,采用dot blot鉴定,确定其中的Apt27和Apt52为候选适配体。MTT试验表明,Apt27和Apt52对CRFK细胞(猫肾细胞)无毒性作用。利用酶联寡核苷酸法(ELONA)测定Apt27和Apt52的解离常数,结果显示分别为18.3249±7.1723 nmol/L和24.7882±10.0067 nmol/L。同时采用dot blot、间接免疫荧光试验(IFA)方法检测Apt27和Apt52对不同病毒的结合情况,结果显示其对猫杯状病毒、猫疱疹病毒的结合力弱,而对FPV的结合能力较强。预测二者二级结构可见,Apt27和Apt52均具有环状、发卡状结构,其中茎环结构可能为适配体特异性识别FPV的基本结构。本研究首次筛选到特异性识别FPV的适配体序列,为FPV的检测与治疗制剂的开发提供了新思路。     

基于氧化石墨烯-SELEX技术对氟苯尼考核酸适配体的筛选及其结构分析

氟苯尼考(FFC)具有胚胎毒性,在食用动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。为建立快速检测动物性食品中FFC残留的方法奠定基础,本研究根据引物设计原则,设计了上下游引物,根据引物序列构建长度为80 bp的随机单链寡核苷酸(ssDNA)文库,其3'端和5'端为固定的20 bp引物结合位点,中间为40 bp的随机序列。通过氧化石墨烯-富集配体系统进化技术(GO-SELEX)筛选,即将经过预处理的ssDNA文库与等摩尔量的FFC及氧化石墨烯(GO)沉淀共孵育。通过GO的π-π共轭键吸附未结合靶标FFC的ssDNA,已结合靶标的ssDNA(FFC-ssDNA)则留在上清液中,通过离心获得FFC-ssDNA复合物。将每一轮筛选的FFC-ssDNA复合物经离心、抽提、醇沉淀回收所得到的ssDNA做为模板进行PCR扩增,通过链霉亲和素将PCR产物的双链DNA(dsDNA)彻底裂解为单链,作为次级ssDNA文库进入下一轮筛选。每一轮的筛选均计算一次回收率,当回收率变化趋于稳定时,引入反筛选物氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP),以去除与FFC特异性结合较差的ssDNA。当回收率达到饱和,筛选停止。最终,根据回收率的计算结果共进行了12轮核酸适配体的筛选,其中有10轮为正筛选,第7轮和第11轮为反筛选。PCR结果显示,经12轮筛选均得到了所需要的目的 ssDNA片段。对第9轮和第12轮的筛选产物克隆并测序,共得到46条不同的核酸适配体序列。经对46条核苷酸序列的二级结构、自由能(△G)预测和亲缘性分析,最终得到A1、A26、A27、A31、B18、B28、B30、B37共8条候选核酸适配体。通过测定8条候选适配体的解离常数(Kd值)分析其与FFC的亲和性。结果显示,8条候选适配体的Kd值在11.811 nmol/L～54.097 nmol/L;利用相同浓度的FFC、CAP、TAP对其中亲和性较高的A26和B18进行特异性试验,结果表明两条核酸适配体均可以与FFC特异性结合,且B18与FFC的特异性结合作用更强,可作为FFC的特异性核酸适配体。本研究首次对FFC的核酸适配体进行SELEX筛选,为建立快速检测动物性食品中FFC残留方法奠定基础。     

牛乳铁蛋白胶体金定量免疫检测试剂卡的研制

本试验旨在建立一种能快速定量检测乳制品中牛乳铁蛋白(BLF)含量的胶体金免疫层析方法。以BLF为免疫原免疫BLAB/c小鼠，用间接ELISA筛选、鉴定获得单克隆抗体；继而用胶体金免疫层析技术建立BLF的检测方法，并对研制的胶体金定量检测试剂卡进行重复性、线性、样本测试相关性和特异性评估。结果显示：本试验制得BLF单克隆抗体2株，效价均大于3.2×10~6;基于这2株单抗建立的BLF胶体金定量检测试剂卡的空白限为21.86μg/mL,变异系数(CV)<13%,线性测试其直线拟合线性回归相关系数R=0.997 7,与液相色谱法检测样本结果的相关系数R=0.988 5,与α-乳白蛋白和β-乳球蛋白均无交叉反应。综上，本试验研制的BLF胶体金定量检测试剂卡可为乳制品中BLF含量的检测提供一种准确、灵敏的方法。     

高效液相色谱串联质谱测定粮谷及饲料中玉米赤霉烯酮及其代谢物和伏马毒素B_1、B_2

为建立粮谷及饲料中玉米赤霉烯酮及其代谢物和伏马毒素B1、B2的高效液相色谱串联质谱检测方法,本试验将样品经甲醇:水(3∶1)提取,强阴离子交换柱(MAX)富集净化,利用C18色谱柱分离,电喷雾串联四极杆质谱ESI源,在多反应监测模式(MRM)下采用正负离子同时扫描,对8种真菌毒素进行高效液相色谱串联质谱法测定。结果经方法学验证,8种物质的回收率大于70%,标准偏差均小于10,变异系数均小于10%,表明该检测方法能够满足包括欧盟、日本、美国等国家和地区对玉米赤霉烯酮及其代谢物,伏马毒素B1、B2等毒素的痕量检测的要求。     

核酸适配体比色法在抗生素残留快速检测中的应用

传统的抗生素残留快速检测方法主要是以抗体为核心试剂的免疫学方法,免疫学检测方法灵敏度好、操作简单快速.但是,抗体的获得需要多次免疫动物或(和)细胞培养,制备周期一般比较长,实验成本相对也较高.另外,抗体长期储存可能会影响效价.核酸适配体是从随机序列中筛选出来的一段单链寡聚核酸,适配体与靶分子之间的分子识别与抗体极为相似,但适配体比抗体具有更高的特异性,在常温下较稳定,不像抗体那样随着温度的变化容易降解.本文对基于核酸适配体的胶体金比色法在抗生素残留快速检测中的应用做一介绍.     

奶牛结合珠蛋白核酸适配体的筛选及鉴定

核酸适配体作为一种优于单克隆抗体的新型识别分子,具有更高的分辨率,能识别配体间一个基团的细微差别,且所需的结合活性位点更小。本研究利用指数级富集配体进化技术(SELEX)筛选特异性结合于奶牛结合珠蛋白(HP)的DNA适配体,并对筛取的适配体进行特性分析。体外构建全长80bp中间含40bp随机序列的单链DNA(ssDNA)文库,通过对循环次数、退火温度及引物比例的优化,建立了适合的筛选体系;以超滤离心管为介质,HP蛋白为靶标,对随机ssDNA文库进行反复的SELEX筛选,从单链DNA文库中筛选能特异性结合HP蛋白的核酸适配体;利用DNAMAN和RNAstructure软件对获得核酸适配体进行一级结构和二级结构分析。结果表明,经过体外8轮筛选,随机ssDNA文库与HP蛋白的结合率由1.86%上升到31.35%,特异性核酸达到最大富集;经克隆和测序,获得了能与HP蛋白特异性结合的5个家族的DNA适配体,同源性均达70%以上,RNAstructure分析其二级结构主要以茎环结构为主,表明ssDNA形成不同的茎环结构可能是适配体与HP蛋白特异性作用的结构基础。初步建立HP蛋白核酸适配体库,筛选到与HP蛋白特异性结合的核酸适配体,为制备以HP为检测靶标的奶牛隐性乳腺炎检测试剂盒奠定基础。     

检测产单核细胞李氏杆菌溶血素的胶体金试纸条制备及初步应用

产单核细胞李氏杆菌为重要的食源性病原菌,本研究旨在建立快速、灵敏、特异的检测方法,提高检测效率和检测通量。李氏杆菌溶血素(LLO)蛋白经原核表达后, 制备单克隆抗体, 测定单克隆抗体的亚型、效价及亲和力。柠檬酸钠法研制LLO胶体金试纸条,并对试纸条的特异性、敏感性、重复性、稳定性及模拟样品进行检测,并初步应用于实际海产品的检测。结果发现,制备的LLO单克隆抗体特异性强、稳定性高、重复性佳、灵敏度较高,亲和力好,亲和力常数为4.25×10⁸ L·mol^－1。人工污染样品试验表明灵敏度与纯细菌培养物基本一致,为3.0×10⁵CFU·mL^-1。将LLO胶体金试纸条应用于500份海产品的实际检测中,产单核细胞李氏杆菌的阳性检出率为2.20% (11/500),略低于国标检测方法(GB4789.30—2010)的2.40%(12/500)和PCR检测方法的2.40%(12/500),三者之间符合率为91.67%。另外缩短检测时间至15 min,检测效率大幅度提高。本研究建立的LLO胶体金检测方法可用于产单核细胞李氏杆菌的快速检测。     

T-2毒素单抗制备及免疫学检测方法的建立

拟制备灵敏度高、特异性强的抗T-2毒素单克隆抗体,并初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)法合成免疫原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,经小鼠免疫、细胞融合、利用ELISA筛选技术筛选出分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用腹腔注射细胞株制备腹水,并进行免疫学特性鉴定,初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。结果显示,筛选出能稳定分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株命名为4F7,经鉴定该细胞株分泌的单克隆抗体(mAb)效价高达1.024×106,亚型为IgG1型,亲和力常数为1.49×10~(11) mol/L,IC50为2.19μg/L,检测限LOD为0.07μg/L,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA交叉反应率均小于0.01%。样品回收率为83.8%~94.3%,变异系数小于15%。本试验制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的T-2毒素单克隆抗体,并建立了T-2毒素的阻断ELISA快速检测方法,为T-2毒素检测提供了技术支撑。     

核酸适体检测赭曲霉毒素A荧光方法的建立

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)普遍存在于谷物等粮食和动物饲料中,是一种可以引起癌症的霉菌毒素。为了快速检测OTA,利用荧光染料PicoGreen识别双链DNA原理,建立了一种基于核酸适体与PicoGreen检测毒素OTA的方法。在10 mmol/L Tris,120 mmol/L Na Cl,5 mmol/L KCl,20 mmol/L CaCl2(pH8.5)缓冲液中,PicoGreen与双链DNA结合后,释放的荧光在3 min内达到峰值(激发波长为480 nm,发射波长为520 nm)。从加样到荧光检测,整个流程可在40 min内完成。检测OTA的灵敏度为1μg/L;检测范围为1μg/L~200μg/L。特异性实验表明:OTA核酸适体-Pico Green方法与黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素无交叉反应。本方法在检测敏感性和特异性方面与传统抗体ELISA方法相当(Kappa值为:0.857)。由于核酸适体成本比抗体低,因此本方法比抗体ELISA方法更具实用价值。     

应用适配体捕获建立H5N1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测技术

基于表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)和适配体捕获相结合技术，建立1种H5N1亚型禽流感病毒快速检测方法。本实验室筛选得到2条针对H5N1亚型禽流感病毒具有良好的特异性和灵敏度的适配体，与磁珠偶联建立针对H5N1亚型禽流感病毒捕获试剂，通过对捕获体系进行原位还原生成纳米银颗粒增强拉曼信号，建立了原位、快速、无损的H5N1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测技术。结果表明：H5N1亚型禽流感病毒在1 058 cm^-1处有特异性拉曼峰谱，该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。该方法的最低检测限达到原病毒液稀释的10¹⁰倍。利用本方法可在10 min内快速检测出待测样本中是否有H5N1亚型禽流感病毒的存在，能够在大体积、低浓度样品中快速检测出目标病原，满足H5N1亚型禽流感病毒临场快检的需求。     

圆弧青霉菌毒素——青霉酸ELISA定量检测试剂盒的研制

为了建立用于定量检测饲料与食品中青霉酸的ELISA试剂盒,试验在合成青霉酸人工抗原并免疫小鼠获得特异单克隆抗体的基础上,利用间接竞争ELISA方法对试剂盒各项技术参数进行测定,最终获得特异、快速的检测试剂盒。结果表明:在优化的条件下,该试剂盒对青霉酸标准品的最低检测浓度为1.6μg/mL;线性方程为y=9.54x+5.844 4(R2=0.996 4),线性范围为0.1～25.6μg/mL;回收试验的平均回收率分别为80.5%、83.3%、85.36%,37℃可保存48 h左右,与黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、伏马毒素等的交叉反应率小于0.01%,具有良好的特异性。说明已初步研制出用于检测饲料中青霉酸的ELISA试剂盒。     

生乳中黄曲霉毒素M1快速检测方法的比对

[目的]分析酶联免疫吸附法（ELISA）测定生乳中黄曲霉毒素M1残留量结果的重现性、回收率和精密度,以及胶体金免疫层析法与其结果的呼应度,证实2种方法联合使用的可行性。[方法]用胶体金快速检测试纸条对生乳样品中的黄曲霉素M1进行检测,并用黄曲霉毒素M1 ELISA检测试剂盒（鲜奶检出下限为0.018μg/kg）做对照试验。[结果]胶体金快速检测试纸条对生乳中不同浓度黄曲霉毒素M1残留量的检测结果呈现梯度效应,并能与ELISA检测试剂盒的定量检测结果呼应。ELISA法对生乳中黄曲霉毒素M1不同浓度残留量的定量试验结果重现性较好,具有较高的稳定性。回收率为94.83%～100.53%,RSD值在1.11%～3.01%之间。[结论]2种快速检测方法对生乳中黄曲霉毒素M1的测定便捷快速,结果稳定准确、可信度高,可作为乳品企业日常快速进行原奶验收工作的基础数据参考。     

基于RNA适配体检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP

旨在建立简单、快速的检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。本研究以含有T7启动子、VC2GEMM-1核糖开关序列或其突变序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的双链DNA为模板,利用T7RNA聚合酶体外转录体系制备VC2、VC2/g20aRNA适配体。通过检测绿色荧光强度分析RNA适配体对c-di-GMP和cGAMP的结合能力。结果表明,转录得到的RNA经过加热变性、缓慢退火后得到VC2RNA适配体和VC2/g20a RNA适配体,在125mmol·L~(-1 )KCl和30mmol·L~(-1 )MgCl_2溶液中孵育180min的优化结合条件下,VC2适配体与c-di-GMP特异性结合,VC2/g20a适配体与cGAMP特异性结合;c-di-GMP对VC2适配体的半数效应浓度(EC50)为(89±1.7)nmol·L~(-1),cGAMP对VC2/g20a适配体的半数效应浓度为(309±4.5)nmol·L~(-1);VC2和VC2/g20a能够分别检测低至5nmol·L~(-1)和20nmol·L~(-1)的c-di-GMP和cGAMP;并且发现转录的RNA混合物在未纯化的情况下同样能够检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。这种方法可以简单快速的检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP,并且为研究其他c-di-GMP和cGAMP合成酶活性提供潜在可能。     

一种黄曲霉毒素M_1快速检测试纸条检测性能的评估

黄曲霉毒素是天然产生的真菌毒素,是饲料的主要污染源之一。本文对黄曲霉毒素M1快速检测试纸条检测性能指标充分评估,确认其是否符合欧盟CRL Guidelines 2010和519/2014/EC标准。基于欧盟参考实验室方案CRL Guidelines 2010对检测试纸条的精密度、特异性、假阳性率和假阴性率、重复性、稳定性、样本差异影响、批间差异及试剂盒稳定性分别检测,并通过胶体金读数仪对检测数据分析。结果发现:该黄曲霉毒素M1检测试纸条可在10 min中检测牛奶中的黄曲霉毒素M1,肉眼判读定性检测灵敏度为50 ng/L;试纸条特异性良好,除黄曲霉毒素M2(交叉反应为0.86%)外,与呕吐毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1等交叉反应均小于0.5%,其余无交叉反应。用胶体金读数仪分析时,试纸条检测灵敏度为21.58 ng/L,定量限为58.11 ng/L;检测60个添加浓度为50 ng/L的牛奶样本时平均值为49.07 ng/L,标准差为6.45 ng/L。因此,该试纸条可作为定性筛选方法检测牛奶中的黄曲霉毒素M1污染,检测能力满足欧盟MRL(50 ng/L)要求。     

胶体金免疫层析法检测谷物中的黄曲霉毒素B1

采用胶体金免疫层析法检测谷物中的黄曲霉毒素B1,谷物样品经提取后,用胶体金免疫层析试纸条法对其进行黄曲霉毒素B1的测定,并与高效液相色谱法进行比较。结果表明:胶体金免疫层析试纸条法与高效液相色谱法的相符率可达90%以上,胶体金免疫层析试纸条法操作简单、快速、方便,可以应用于谷物中的黄曲霉毒素B1的现场快速检测。     

动物卫生风险评估研讨会在青岛召开

正与风险评估创新团队研究建立了牛奶黄曲霉毒素M1(AFM1)的核酸适配体检测新方法。该方法具有灵敏度高、准确度高、操作简便等优点,为快速检测牛奶中的AFM1开辟了新路径。相关研究成果发表在《化学前沿(Frontiers in Chemistry)》上。据团队执行首席郑楠研究员介绍,AFM1是牛奶中最重要的霉菌毒素,目前AFM1常用检测方法有HPLC、LC-MS/MS等,但这些方法对样品预处理要求高,且耗费时间长。为进一步提高样品检测的质量和效率,研究人员经过长期摸索和反复验证,成功建立了利用核酸适配体技术检测牛奶AFM1的新方法。研究表明,在核酸适配体传感检测中,AFM1与反应荧光强度呈线性关系,线性范围为1～100纳克/毫升,AFM1检测限为0.5纳克/毫升,加标回收率可