产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

为了对产气荚膜梭菌α毒素进行快速、有效的检测,本研究以单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)为基础,建立了双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)方法。纯化原核表达的α毒素蛋白为免疫原,制备腹水型mAb并分离纯化作为检测抗体,免疫新西兰大白兔制备抗α毒素多克隆抗体纯化后作为捕获抗体,通过试验优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。DAS-ELISA方法对α毒素的有效检测范围为5.86³75μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A375μg/L,最低检测线为4.57μg/L,比多抗-多抗双夹心ELISA具有更高的特异性和敏感性。初步应用结果显示,相同培养条件下,A^E型产气荚膜梭菌标准菌株的培养上清中,α毒素含量差异较大,A型菌(NCTC528)中α毒素含量显著高于其他菌型。本研究成功制备了高特异性的mAb,并建立了特异、灵敏、稳定的DAS-ELISA方法,为高效检测α毒素提供了有效工具。     

免疫亲和色谱柱-高效液相色谱法测定饲料中赭曲霉毒素A的研究

本文建立了饲料中赭曲霉毒素A(OTA)的免疫亲和柱净化-高效液相色谱荧光检测方法。样品用甲醇-水(体积比80∶20)提取,通过免疫亲和柱富集和净化,以乙腈和2%乙酸溶液为流动相(体积比44∶56),Agilent C18色谱柱分离,荧光检测器检测(λex-332 nm,λem=460 nm)。OTA的线性范围为0.1～100.0 ng/mL,r=0.99989。方法检测限为0.2μg/kg,定量限为0.6μg/kg。样品中赭曲霉毒素A的加标回收率为75%～92%,相对标准偏差为1.65%～3.61%。     

T-2毒素单抗制备及免疫学检测方法的建立

拟制备灵敏度高、特异性强的抗T-2毒素单克隆抗体,并初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。采用N,N’-羰基二咪唑(CDI)法合成免疫原T-2-BSA和包被原T-2-OVA,经小鼠免疫、细胞融合、利用ELISA筛选技术筛选出分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用腹腔注射细胞株制备腹水,并进行免疫学特性鉴定,初步建立T-2毒素阻断ELISA检测方法。结果显示,筛选出能稳定分泌抗T-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株命名为4F7,经鉴定该细胞株分泌的单克隆抗体(mAb)效价高达1.024×106,亚型为IgG1型,亲和力常数为1.49×10~(11) mol/L,IC50为2.19μg/L,检测限LOD为0.07μg/L,与其他霉菌毒素及载体蛋白BSA和OVA交叉反应率均小于0.01%。样品回收率为83.8%~94.3%,变异系数小于15%。本试验制备出了灵敏度高、特异性强、亲和力高的T-2毒素单克隆抗体,并建立了T-2毒素的阻断ELISA快速检测方法,为T-2毒素检测提供了技术支撑。     

赭曲霉毒素A完全抗原的制备及鉴定

赭曲霉毒素A(OTA)是一种对人和动物具有广泛毒性的霉菌毒素,为建立OTA在食品和饲料中的快速检测方法,采用活性酯法(NHS)将OTA与牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,分别制备了免疫原OTA-BSA和包被原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE鉴定表明,OTA与BSA和OTA与OVA偶联成功,偶联物OTA-BSA和OTA-OVA的偶联比分别为7∶1和4.5∶1。用免疫原OTABSA免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,用OTA-OVA包被ELISA板进行检测,小鼠血清中抗OTA的抗体效价最高可达1∶51 200。表明制备的免疫原OTA-BSA具有良好的免疫原性,为OTA单克隆抗体的制备奠定了基础。     

液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中17种霉菌毒素

本研究旨在建立饲料中17种霉菌毒素的液相色谱串联质谱快速分析方法。样品用甲醇∶水(80∶20,v/v)混合溶剂超声提取,经离心后提取液直接用0.1%甲酸溶液(5 mmol/L乙酸铵)稀释后进行液相色谱-串联质谱分析。采用Acquity BEH C18色谱柱分离,用0.1%甲酸溶液(5 mmol/L乙酸铵)-甲醇作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正离子模式电离(雷索酸内酯类化合物为负离子模式),多反应监测模式检测,基质校准外标法定量。各物质峰面积与样品质量浓度(6种黄曲霉毒素浓度范围0.15~25μg/L,T-2和HT-2浓度范围为0.25~25μg/L,赫曲霉毒素A浓度范围为0.125~12.5μg/L,2种伏马毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度范围为5~500μg/L,5种雷索酸内酯类化合物浓度范围为1.25~250μg/L)呈良好的线性关系,线性回归系数均大于0.99。添加回收实验结果表明,17种霉菌毒素猪、鸡配合饲料中平均添加回收率在77.5%~90.9%,批间RSD在4.30%~9.13%。17种霉菌毒素在猪、鸡配合饲料中的检测限为0.50~10.0μg/kg,定量限为2.50~30.0μg/kg。该方法能满足饲料中17种霉菌毒素含量分析的要求。     

MECC-DAD和HPLC-FLD测定牛乳中5种黄曲霉毒素的方法比较研究

建立高效胶束电动毛细管色谱耦合二极管阵列检测器（micellar electrokinetic capillary chromatographydiode array detector,MECC-DAD）检测牛乳中痕量黄曲霉毒素的新方法,采用高效液相色谱-荧光检测器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector,HPLC-FLD）法及MECC-DAD法检测牛乳样品中5 种黄曲霉毒素的残留量,考察2 种检测技术的特异性。牛乳样品经免疫亲和柱净化后,MECC-DAD法采用未涂层熔融石英毛细管柱进行分离,以7.5 mmol/L四硼酸钠、30 mmol/L十二烷基磺酸钠及体积分数5%乙腈体积比1∶1∶1的混合液（pH 8.5）为缓冲液,检测波长为214 nm;HPLC-FLD法采用C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）进行分离,乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,荧光检测器激发波长360 nm、发射波长440 nm。结果表明：MECC-DAD法的色谱图峰形更对称、平滑、尖锐,无拖尾现象;MECC-DAD和HPLC-FLD法的检出限分别为0.182～1.669、0.014～0.058 μg/L,MECC-DAD法的检出限虽高于HPLC-FLD法,但也能满足牛乳中黄曲霉毒素的测定要求;HPLC-FLD法的精密度稍高于MECC-DAD法;MECC-DAD法的加标回收率为80.3%～137.0%,HPLC-FLD法的加标回收率为79.6%～134.0%,二者相当;2 种方法对市售牛乳样品的定量检测结果偏差为P＝0.900＞0.05,没有显著性差异。MECC-DAD法分离快速、高效、经济,更适合牛乳样品中黄曲霉毒素残留量的检测。     

饲料中黄曲霉毒素检测及其对牛奶品质的影响

黄曲霉毒素是一种霉菌产生的毒素，易存在各类饲料和食品中。本研究采用免疫亲和柱-荧光光度法对牛奶中的黄曲霉毒素M1进行测定，而饲料中的黄曲霉毒素B1采用酶联免疫法检测，研究结果发现：本实验中的黄曲霉毒素M1的荧光光度计的最佳光谱发射波长为450 nm，分析阴性牛奶产品的黄曲霉毒素M1含量，确定数据的精确性，牛奶回收率为76.67%～93.33%，变异系数为0.45%～2.8%，满足我国制定的检测标准，该方法操作简单、快速和安全。奶牛饲料中青绿饲料、粗饲料、能量饲料和蛋白饲料样品的黄曲霉毒素B1的测定率为100%，奶牛饲料中被检测的青绿饲料、粗饲料、能量饲料和蛋白质饲料阳性样品中黄曲霉毒素B1的含量分别为11.45、4.25、5.24和7.58 μg/kg，均小于20μg/kg（国家卫生部门制定标准），属于轻度污染|不同类型牛奶样品中阳性最高值为0.201 μg/kg，阳性最低值为0.004 μg/kg，平均值最大为0.084 μg/kg，严重超过我国卫生部门制定的标准。 [关键词]饲料|黄曲霉毒素|牛奶品质     

高效液相色谱法测定貉子肉中褪黑素残留量的研究

本研究建立一种检测貉子肉中褪黑素药物残留的高效液相色谱——荧光检测法。貉子肉经乙酸乙酯提取,旋转蒸发至干,溶解残留物,加入水饱和的正己烷去脂肪,Waters Oasis HLB柱净化。以20 mmol/L NaAc-HAc溶液和甲醇溶液为流动相,等度洗脱,检测波长:Ex=285nm,Em=345 nm。结果表明,褪黑素在0.1~100μg/L呈良好的线性关系,r均大于0.9999。方法的最低检出限为0.25μg/kg,定量限为1μg/kg。在1、5和10μg/kg的添加水平上,其回收率范围在72.0%~90.4%之间,相对标准偏差(RSD)为1.2%~2.4%。     

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素

建立免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素(AF)B1、B2、G1和G2。该方法样品用甲醇-水提取,稀释后经免疫亲和色谱柱纯化,应用高效液相色谱法检测。以Cloversil C18柱为分离色谱柱,甲醇-水(45∶55,体积/体积)溶液为流动相梯度洗脱,流速0.8 m L/min,柱温30℃,进样量20μL,荧光检测器检测,激发波长360 nm,发射波长440 nm。试验结果表明:空白样品分别按照1、10、20和50μg/kg添加黄曲霉毒素,平均回收率在85.9%~113.2%,精密度10%,4种毒素在标准溶液为0、1、5、10和50 ng/m L的条件下呈良好的线性关系,相关系数分别为0.999 8、0.999 9、1.000 0和0.9998,根据3倍信噪比的峰响应值,确定黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的检测灵敏度分别为0.2、0.2、0.3和0.3μg/kg。该方法简单快速、灵敏度高和溶剂用量少且环保,适用于饲料中的黄曲霉毒素总量的测定。     

河豚毒素荧光偏振免疫分析方法的建立

河豚毒素主要存在于河豚鱼中,是一种致命的神经毒素。将量子点标记于河豚毒素,并将其作为示踪物,获得高且稳定的荧光信号,建立荧光偏振免疫分析技术检测河豚毒素。所建立的方法检测河豚毒素检测范围为1.36~101.27μg/L,IC50值为11.76μg/L,检测限为0.67μg/L。在该方法的检测范围内标准平均回收率为(99.91±2.60)%,变异系数为2.60%。与竞争性ELISA相比较,本方法河豚毒素测定值与竞争性ELISA测定值呈线性相关,且具有简单、快速等特点,可应用于临床诊断和食品安全检测。     

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。     

黄曲霉毒素B_1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮联合对奶山羊肠道微生物的影响

为研究黄曲霉毒素B_1(AFB_1)、赭曲霉毒素A(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZEN)联合对奶山羊肠道微生物组成及多样性的影响,本研究选取体况相近的健康崂山奶山羊20头,分为5组,每组4头,A组为对照组,饲喂不添加毒素的基础日粮;B、C、D、E组分别在日粮中添加50μg/kg AFB_1+500μg/kg ZEN、50μg/kg AFB_1+100μg/kg OTA、50μg/kg AFB_1及50μg/kg AFB_1+100μg/kg OTA+500μg/kg ZEN。预试期7d,正试期14d。在试验期第11天采集粪便样品,利用基因组DNA提取试剂盒提取粪便总DNA,对总DNA进行16S rRNA扩增,构建奶山羊肠道微生物16S rRNA基因克隆文库并进行数据分析。经稀释曲线和多样性指数分析显示,单一AFB_1或与其他毒素联合处理后奶山羊肠道微生物多样性有降低趋势,但差异不显著(P0.05),而奶山羊肠道菌群总数在AFB_1与其他毒素的联合处理后显著降低(P0.05)。对获得的OTUs代表序列进行物种注释后发现,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、软壁菌门(Tenericutes)为山羊肠道中主要的细菌类群;经LEfSe分析显示,AFB_1、OTA和ZEN 3种毒素的联合作用可显著增加琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)和气单胞菌科(Aeromonadales)丰度。而未处理组的霍尔德曼氏菌(Holdemania)和BF311拟杆菌的丰度显著高于其他组(P0.05)。以上结果表明,AFB_1、ZEN和OTA联合能影响山羊肠道微生物区系结构,且影响程度依次为:AFB_1+OTA+ZENAFB_1+OTAAFB_1+ZENAFB_1。     

金黄色葡萄球菌肠毒素ELISA检测方法的建立及应用

采用金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)免疫Balb/c小鼠制备相应的单克隆抗体(m Ab),并以此为基础建立SEA和SEB的ELISA检测方法,用于牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。SEA双抗体夹心法ELISA的曲线范围是1~16μg/L,相关系数R2=0.9996,检测牛乳的检测限是0.431μg/L,加标4μg/L和10μg/L,准确度分别为89.18%和97.62%。SEB双抗体夹心法ELISA的曲线范围是0.5~8μg/L,相关系数R2=0.9998,检测牛乳的检测限是0.335μg/L,加标4μg/L和10μg/L,准确度分别为107.83%和89.88%。     

橙皮苷对3种霉菌毒素处理的HepG2细胞增殖和迁移的影响

探讨橙皮苷对3种霉菌毒素处理的HepG2细胞增殖和迁移作用的影响。采用MTT、Griess、细胞划痕愈合试验分别检测细胞活力、细胞分泌NO、细胞迁移率。结果3种毒素对HepG2细胞增殖的影响随毒素浓度的增加呈现先促进后抑制的作用,低浓度DON、OTA(0.04μmol/L和0.08μmol/L),ZEN(<2μmol/L)显著提高HepG2细胞活力及促进增殖,高浓度霉菌毒素明显降低HepG2细胞活力及抑制细胞增殖。与霉菌毒素组比较,橙皮苷组HepG2细胞活力降低及增殖减弱,表示橙皮苷能缓解霉菌毒素对细胞的毒性。与空白对照组比较,霉菌毒素组HepG2分泌NO量显著降低,不同浓度及不同霉菌毒素对NO分泌没有明显影响;与霉菌毒素组比较,橙皮苷组不同浓度DON处理的细胞分泌NO差异不显著。低浓度DON毒素(0.08μmol/L^2μmol/L)处理HepG2细胞24、36、48 h后,DON毒素能极显著促进HepG2细胞迁移,随着霉菌毒素对细胞处理时间延长细胞迁移快,而高浓度DON毒素(10μmol/L、50μmol/L)对促细胞迁移影响显著低于低浓度DON。结果低浓度DON霉菌毒素促进HepG2细胞增殖及迁移,表明DON毒素对HepG2具有潜在的致癌性,橙皮苷能抑制HepG2细胞增殖及缓解霉菌毒素毒性的作用。     

植物炭黑（百草霜）微晶结构及其对霉菌毒素的体外吸附效果

本试验旨在测定植物炭黑(百草霜)的微晶结构及其对霉菌毒素的体外吸附效果。按文中试验方法,测定植物炭黑(百草霜)的微晶结构及其在p H 6.0磷酸盐缓冲液(PBS)下对呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素(OTA)的吸附率及吸附量。结果表明：(1)植物炭黑(百草霜)的比表面积为1 440.09 m²/g、孔体积为1.28 cm³/g、孔径为3.56 nm,其微晶结构(比表面)明显优于蒙脱石。(2)在pH 6.0磷酸盐缓冲液(PBS)中,对不同浓度霉菌毒素均具有较好的吸附效果。对呕吐毒素(DON)的吸附率在91%以上,对黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)及赭曲霉毒素(OTA)的吸附率均在99%以上,且不受以上3种霉菌毒素浓度的影响。     

反相高效液相色谱法测定猪尿中的莱克多巴胺

本文对猪尿中莱克多巴胺的高效液相色谱检测方法进行了优化,猪尿碱化后用叔丁基甲基醚提取莱克多巴胺,用硅胶柱净化;以乙腈-水-冰乙酸-辛烷磺酸钠为流动相,反相高效液相色谱荧光检测法进行测定,激发波长226nm,发射波长305nm,方法的检测限为10μg/L,定量限为50μg/L,回收率大于70%,变异系数小于10%。     

利用荧光定量技术检测生鲜乳中黄曲霉毒素M_1

本试验利用荧光定量检测技术检测生鲜乳中黄曲霉毒素M_1,最低检出限为0.047μg/L;取空白生鲜乳样品按0.05μg/L、0.1μg/L黄曲霉毒素M_1标准品进行添加,回收率均在90.00%～110.00%之间。各添加浓度批内、批间变异系数均低于15%;用该黄曲霉毒素M_1荧光定量检测卡和仪器法分别对50份生鲜乳盲样进行测定,结果全部相符,提示该法简便快捷、检测结果可靠,可用于黄曲霉毒素M_1的快速检测。     

泌阳县肉牛饲料原料霉菌毒素污染状况调查分析

[目的]为了解掌握我省肉牛饲料中霉菌毒素污染情况,有针对性的指导养殖场户及饲料加工企业开展霉菌毒素防控,避免霉菌毒素污染对饲料品质和肉牛健康的危害,降低经济损失。[方法]本研究对来自河南省泌阳县8个养殖场户的22份肉牛饲料原料进行分析,采用ELISA方法测定了饲料原料中黄曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、赭曲霉毒素A（OTA)、呕吐毒素（DON）及T-2毒素（T-2）的含量。[结果]结果表明,在所检测的22份饲料原料中都存在不同程度的霉菌毒素污染情况,其中,72.73%的饲料原料受到2种及以上霉菌毒素污染。AFB1是污染最为严重的毒素,检出率高达90.91%,超标率达59.1%,尤其是在麦秸、花生秧和玉米中的污染表现得更为突出。其次是T-2毒素,检出率为77.27%,在麦秸和青贮玉米中污染严重。DON、ZEN及OTA毒素检出率为36.36%、27.27%及27.27%,其中,DON毒素的最大检测值为5830.3 μg/kg。[结论]以上结果表明,泌阳县肉牛饲料原料中霉菌毒素污染现象普遍存在,霉菌毒素共存现象也较为严重。     

配合饲料中赭曲霉毒素A酶联免疫快速检测方法的研究

为弱化猪配合饲料中基质的复杂性对赭曲霉毒素A(OTA)检测的影响,对样品前处理进行优化,并结合酶联免疫试剂盒,构建一种快速及精确检测配合饲料中OTA的方法。结果表明:采用60%甲醇水提取液提取,并稀释10倍的前处理方法,当OTA质量浓度为0~2.700μg/kg时,线性关系良好,IC50的变动范围为0.420~0.498μg/kg,检出限(LOD)为0.500μg/kg。与国标法结果一致,此方法具有可行性。配合饲料的加标回收试验结果显示,OTA回收率为80.7%~113.5%,变异系数为4.45%~8.67%。试验适用于配合饲料中赭曲霉毒素A的检测。     

双抗夹心ELISA检测兔出血症病毒抗原方法的建立及初步评估

为建立一种快速、特异性强的用于检测兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)抗原的双抗夹心ELISA方法,本研究通过抗体配对实验,确定以抗兔出血症病毒结构蛋白VP60单克隆抗体9H9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的9H9为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法。通过优化,确定最佳条件为:0.5μg/m L稀释后的9H9作为捕获抗体,底物显色液37℃包被2 h 4℃过夜,1%明胶溶液37℃封闭2 h,用含10%胎牛血清的PBST按5μg/m L稀释后的辣根过氧化物酶标记的9H9作为检测抗体,37℃作用15 min。建立的ELISA方法与杯状病毒科其他病毒无交叉反应,应用本方法和RT-PCR方法对85份兔肝脏样品进行检测,证明双抗夹心ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,有望作为临床快速检测的一种简便方法。