猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

根据猪流行性腹泻病毒S基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从广东省某猪场采集的初生仔猪腹泻样品检测猪流行性腹泻病毒,并将其克隆测序分析。结果表明,病料样品中有猪流行性腹泻病毒,S基因与KNU-0801、KNU-0901亲缘关系最近,处于同一个分支;与弱毒疫苗株CV777的S基因亲缘关系较远,处于另外一个分支。     

近期暴发仔猪流行性腹泻的探讨

2011年底,全国很多地区暴发猪流行性腹泻疫情,给我国的养猪业造成了巨大的损失.福建省福州、厦门、南平等地也发生多起仔猪流行性腹泻,经济损失巨大.采用RT-PCR检测证明是猪群感染了流行性腹泻病毒(PEDV),对扩增片段进行测序,结果表明检测到的流行性腹泻病毒的S基因发生了变异,是由流行性腹泻病毒变异株引起的.S基因序列分析发现该毒株与韩国毒株同源性高.猪流行性腹泻病毒(PEDV)经典毒株与变异毒株共存.许多专家采用多种防控措施,获得很多经验,但都不理想.对于流行性腹泻病毒的防控,借鉴外国的经验,采用青岛易邦的流行性腹泻病毒变异株冻干活苗口服防疫效果明显,初生乳猪的发病率降低至5%,死亡率降低至2%.     

一例猪轮状病毒感染引发仔猪腹泻的诊断

为了查明贵州省黔西县某猪场仔猪持续腹泻、消瘦死亡的病因,试验采用RT-PCR法对送检样品进行猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒检测,并对RT-PCR产物进行测序分析。结果表明:送检仔猪腹泻为猪轮状病毒感染所引起,经序列分析发现该毒株属猪A群轮状病毒,并与G10血清型位于同一遗传进化分支。说明近年来在普遍发生的猪腹泻病例中,除猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒外,还存在猪轮状病毒感染的情况。     

一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定和遗传进化分析

从陕西地区26个疑似猪流行性腹泻病毒感染的猪场,采集发病仔猪的肛门拭子、粪便以及死亡仔猪的小肠,将其接种于Vero细胞,在添加胰酶的情况下,连续传代培养并观察,直至细胞出现典型的合胞体病变,经RT-PCR检测、测序、基因比对分析与动物回归实验,最终确定分离到一株PEDV病毒强毒株。经过测定毒株的S基因序列,进行序列比对分析和遗传进化分析,发现本次分离到的毒株与疫苗株CV777同源性较低,进化分支位于目前流行的PEDV G2a亚群。     

猪流行性腹泻病毒HeB10/2014株的分离与鉴定

为确定2014年河北某猪场哺乳仔猪群腹泻的病原,本研究从该发病猪场采集了22份临床样品,采用PCR方法进行腹泻病原的检测。结果显示其中17份样品为猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性,而猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)均为阴性。选取其中5份PEDV阳性样品在Vero细胞中进行病毒的分离,结果显示,仅一份样品在接种细胞24 h后即可观察到细胞病变。对病变细胞进行RT-PCR及间接免疫荧光鉴定均为PEDV阳性。将分离的病毒株命名为He B10/2014。将其在Vero细胞中传至F5代次后病毒增殖明显增快,病毒滴度于感染细胞24 h达到峰值。对分离株的S基因进行克隆和测序分析,结果显示该病毒分离株符合国内近年来流行病毒株S蛋白的变异特征,即在S蛋白中存在4个连续氨基酸的插入(~(59)QGVN~(62))和3个氨基酸的缺失(~(14)0N和~(163)NI~(164))。本研究结果表明分离获得的HeB10/2014株为国内近年来新的PEDV流行株。     

猪流行性腹泻病毒(PEDV)辽宁株序列测定及分析

为弄清2014年沈阳某猪场腹泻原因,应用RT-PCR方法对采自该场样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1基因扩增,并将产物纯化后测序、分析。结果得到长为2 376 bp的S1基因序列;本病毒与2013年美国暴发毒株以及我国2010年毒株核苷酸和氨基酸同源性较高,而与疫苗株同源性较低;同时存在氨基酸的插入、缺失及糖基化位点的改变;在进化树上,与2010-2011年在我国暴发的猪流行性腹泻病毒为与同一亚群,与2013年美国毒株也有较近的亲缘关系。表明分离到猪流行性腹泻病毒,此病毒已发生部分变异,需给予密切重视。     

猪流行性腹泻病毒河南流行株S基因的克隆与遗传进化分析

近年来,我国大多省市暴发新生仔猪严重流行性腹泻,给养猪业造成巨大经济损失。为分析猪流行性腹泻病毒(PEDV)在河南省的流行和遗传变异情况,本研究对2014—2015年收集的30份临床腹泻样品,进行RT-PCR检测,对检测为阳性的PEDV样品进行S基因的克隆与序列分析。结果表明,30份临床腹泻样品中,RT-PCR检测出22个PEDV阳性样品,克隆的22条PEDV S序列与GenBank中发表的29条PEDVS基因序列核苷酸同源性为93.1%~99.2%。与经典毒株相比,22株河南流行株在S1区域存在碱基的插入、缺失现象;S基因遗传进化树表明,PEDV分为2群,河南流行株均属于PEDVП群,与近年国内分离株和韩国野毒株有较近亲缘关系,而与欧洲株以及中国目前使用的疫苗株亲缘关系较远,基因差异较大。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

猪丁型冠状病毒的分离鉴定

2016年从某商品化猪场采集到6份疑为病毒性腹泻的腹泻仔猪小肠样本,利用RT-PCR对样品进行检测,检出1份猪丁型冠状病毒(PorcineDeltaconoravirus,PDCoV)阳性样品,使用ST细胞进行病毒分离和传代。通过细胞病变(CPE)、RT-PCR及S基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定,试验结果表明,已成功分离到一株能在ST细胞上稳定增殖并能产生典型CPE的猪丁型冠状病毒,命名为SCMS株。该毒株S基因长度为3480个核苷酸,与GenBank中登录23个参考毒株之间的同源性为95.9%～98.5%,其中与2018年山东分离株SD-11-2018同源性最高,为98.5%。该毒株的成功分离为进一步开展PDCoV的生物学特性研究和疫苗研制奠定了基础。     

一起猪流行性腹泻病毒和猪链球菌混合感染引发仔猪拉稀病例的诊断及分析

为确诊广西一存栏1000头母猪的某规模养猪场2耀3日龄仔猪临床持续表现严重拉稀症状的病因,研究对拉稀仔猪进行了临床诊断和实验室诊断。对拉稀仔猪的发病情况调查,临床症状和病理变化观察,实验室细菌分离培养及鉴定,进行PCR/RT-PCR方法检测可能引起仔猪腹泻的常见疫病病毒(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型)以及常见肠道腹泻病毒(流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪丁型冠状病毒)。结果在2窝拉稀仔猪肠系膜淋巴结中均分离到猪链球菌2型(S.s2),同时在拉稀仔猪肠道中均检测到猪流行性腹泻病毒(PEDV),而其它病原检测均为阴性,表明S.s2和PEDV混合感染可能是引起本次仔猪拉稀病例的主要原因。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒S、M和N基因的遗传变异分析

为了解陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传和变异情况,采集陕西省部分地区规模化猪场的5份疑似PEDV感染的猪小肠内容物,进行PEDV S、M和N基因的RT-PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传变异分析。结果表明,5份病料均能扩增出PEDV S、M和N基因,5株病毒分别命名为SXSL、SX-BJ、SX-YL、SX-WN和SX-HZ株。序列分析表明,5株毒株之间的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为96.7%~99.8%、98.4%~100%和97.2%~99.9%;氨基酸序列的同源性分别为97.4%~99.9%、98.2%~100%和98.2%~100%。该5株病毒与中国疫苗株CV777的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为93.9%~99.8%、98.1%~100%和95.3%~99.9%,氨基酸序列的同源性为93.6%~99.9%、96.2%~100%和98.2%~100%。遗传进化分析结果显示,5个陕西分离株的S基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远,与近年来中国株、日本株以及韩国株亲缘关系较近。SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较近,且与中国株CHGD-01亲缘关系密切。SX-WN株和SX-HZ株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远。该5株病毒的S基因以及SX-WN株和SX-HZ株的M基因和N基因变异程度较大,而SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株三个流行株均与中国株CHGD-01亲缘关系密切,并且与近年在陕西省流行的PEDV也不完全相同。     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

猪流行性腹泻病毒HB/HEBEU/2020株全基因组遗传变异与重组分析

【目的】了解猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的基因组特征及变异规律。【方法】以3只发病仔猪小肠病料作为模板,采用RT-PCR技术检测病原。以检测阳性的肝脏组织RNA为模板,进行RT-PCR,分段扩增PEDV全基因组,使用DNAStar软件对PEDV基因组测序结果进行剪辑、拼接和相似性分析,利用Mega X 10.0.5软件对PEDV基因组和S基因进行遗传进化分析;利用RDP4软件对PEDV基因组进行重组分析。【结果】PCR检测结果表明,3只病仔猪的小肠组织均检测到PEDV阳性。采用RT-PCR分段扩增成功获得1株PEDV全基因组序列,命名为HB/HEBEU/2020株,基因组大小为28 038 bp,含有7个开放阅读框,从5'到3'依次为复制酶1a基因、复制酶1b基因、S基因、ORF3基因、E基因、M基因和N基因。相似性分析结果显示,HB/HEBEU/2020与SNJ-P、USA/Colorado/2013和HB2018等变异毒株全基因组和S基因的相似性均较高,分别为97.8%~99.3%和95.7%~98.8%,在所有市售疫苗株中,与变异型疫苗株AJ1102毒株全基因组和S基因的相似性分别为98.3%和97.3%;遗传进化分析结果显示,21株PEDV可划分为G1群和G2群2个分支,G1群进一步分化为G1a亚群和G1b亚群,G2群进一步分化为G2a亚群和G2b亚群,HB/HEBEU/2020属于G2a亚群。在G2群内,所有流行株均为2010年后出现,HB/HEBEU/2020与市售疫苗株AJ1102遗传距离较近,其次是LW/L,与CV777和attenuated CV777株遗传距离较远;经重组分析,HB/HEBEU/2020基因组可能为重组毒株,存在3个潜在的重组事件,重组事件1~3的断点分别为15 918—22 119、100—734和2 214—2 729 bp,其中重组事件1和2发生概率较大。【结论】HB/HEBEU/2020为1株变异型PEDV,与以CV777为代表的经典毒株亲缘关系较远,与2010年后中国发生的变异型毒株亲缘性较近,并且存在潜在重组事件。本研究结果可为调研中国当前PEDV进化和变异提供重要资料,为遏制PEDV蔓延与进化、制定合理防控方案提供理论和现实依据。     

2017年江西部分地区PEDV分子流行病学调查

为了解江西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行和变异情况,本研究利用RT-PCR方法对2017年采自江西省部分地区规模化猪场182份腹泻仔猪小肠组织和粪便样品进行检测,并设计了2对引物对37份阳性病料的S基因进行扩增、克隆及序列测定,以及与GenBank中登录的22株PEDV S基因参考序列进行遗传进化分析。结果显示,37株PEDV江西流行株的S基因序列长为4 158或4 161 bp,编码1 385或1 386个氨基酸,全部为Group 1型,与美国流行毒株较为接近,而与欧洲毒株(Br1/87)及疫苗株(CV777)亲缘关系较远;37株PEDV中有36株为G1-1亚群,1株为G1-2亚群;37株PEDV江西毒株间的S基因核苷酸序列同源性为96.9%～100.0%,氨基酸序列同源性为96.1%～100.0%,与22株参考毒株的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为92.7%～100.0%和91.5%～100.0%;相较于CV777疫苗株,PEDV江西流行毒株的S基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了2017年江西部分地区PEDV的流行与变异情况,为指导江西省PEDV的科学防控提供了参考依据。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

2011年—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S(GenBank登录号:JN547228)、疫苗株CV777(GenBank登录号:AF353511)和Attenuated DR13(GenBank登录号:JQ023162)的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。     

广西部分猪场猪流行性腹泻病毒S基因克隆及序列分析

采集广西25个猪场的病料,对猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性组织样品进行全S基因扩增.将41株全S基因进行序列比对及遗传进化分析,41株PEDV的S基因之间核苷酸同源性为94.8％～100％,与参考毒株核苷酸同源性为89.3％～99.4％.S基因进化树图谱显示,广西当前流行的PEDV可分为2个谱系.Attenuated...     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^7.50TCID₅₀/mL。该毒株全基因组序列长28 038 bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

Sequence Analysis of S Gene of 6 Strains of Porcine Epidemic Diarrhea Virus from Guizhou

In order to understand the characteristics of S gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Guizhou province, and grasp the genetic variation of PEDV, according to 3 pairs of specific primers designed in the test, S gene of 6 strains of PEDV from Guizhou were amplified by RT-PCR, cloned and sequenced. Nucleotide sequence and phylogenetic tree of 6 strains of PEDV from Guizhou and reference strains were analyzed by biological information software. The result showed that the length of S gene genome of 6 strains of PEDV from Guizhou was 4 161 bp, encoding 1 387 amino acids, and the nucleotide homologies of domestic and foreign PEDV reference were from 93.3% to 98.8%, the amino acid identity were from 91.6% to 98.9%. Phylogenetic tree analysis results showed that the 6 strains were close to the American strain, Vietnam strain and the Shandong strain.They were far from the CV777, LZC, Brl and 83P-5.The experiment showed that the S gene of PEDV in Guizhou had a certain degree of amino acid change in recent year with a trend of variation. The study provided a theoretical basis for the prevention and control of PEDV in Guizhou province.