蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及免疫原性鉴定

为获得蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)25型的VP7原核表达蛋白,本试验以蓝舌病病毒重组质粒为模板,PCR扩增VP7基因,将其克隆于pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达His-BTV-VP7蛋白。在变性条件下用镍亲和层析柱纯化His-BTV-VP7蛋白,经Western blotting及ELISA鉴定其免疫原性。结果显示,His-BTV-VP7蛋白以包涵体形式表达,大小约为40 ku;Western blotting和ELISA检测此原核表达蛋白能与山羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性。本研究为后续建立蛋白芯片检测方法奠定了基础。     

长白猪肿瘤坏死因子α成熟肽基因克隆、表达及其表达产物活性检测

本研究旨在克隆和表达猪肿瘤坏死因子成熟肽基因及其表达蛋白的生物活性。根据GenBank登录的猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)成熟肽基因序列设计一对上下游引物。应用RT-PCR技术直接从丹系长白猪脾脏组织中扩增猪的TNF-α成熟肽基因。将RT-PCR扩增到的特异性片段克隆到pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-TNF重组质粒,经宝生物(大连)有限公司测序,该TNF-α成熟肽基因的长度为465 bp,编码154 aa。以重组克隆质粒pGEM-TNF为模板,PCR扩增猪TNF-α成熟肽基因,并将其插入原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明表达的融合蛋白约为38 ku,重组蛋白以包涵体形式表达,表达重组蛋白约占菌体总蛋白的36.8%。细胞毒T细胞试验表明所表达的蛋白经初步纯化、变性复性后,可明显增强淋巴毒性T细胞作用。结果提示长白猪肿瘤坏死因子得到了成功克隆与表达,表达的蛋白产物具有一定的生物活性。     

迟缓爱德华菌菌毛蛋白原核表达及多抗血清制备

为研究迟缓爱德华菌菌毛蛋白PILI的功能和免疫原性,本研究利用PCR方法从迟缓爱德华菌基因组中克隆出pili基因,并将其构建到pET-32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDSPAGE和Western blot方法验证重组蛋白表达。用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别迟缓爱德华菌PILI蛋白,为研究PILI蛋白奠定基础。     

副猪嗜血杆菌Plp4蛋白的原核表达及免疫原性分析

为原核表达副猪嗜血杆菌P1p4蛋白,本研究通过PCR方法扩增P1p4全长基因并克隆于pET-28a(+)载体中,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态中,采用0.4 mM IPTG经22℃诱导表达了35 ku的重组蛋白.经western blot试验证明Plp4蛋白具有良好的反应原性,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA检测表明制备的抗血清效价在1∶15000以上,表明P1p4蛋白具有良好的免疫原性.     

赤羽病病毒Gc_(405aa—480aa)肽段的高效可溶性表达及抗原性鉴定

为表达和鉴定赤羽病病毒Gc蛋白强抗原性肽段,对Gc蛋白的1个75氨基酸肽段(405aa—480aa)编码序列,经密码子优化后进行基因合成,构建重组表达载体p ET-Gc_(405aa—480aa),转化表达菌株BL21(DE3),在28℃用0.1 mmol/L IPTG诱导重组肽段表达。将重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段,通过Ni~+-NTA树脂亲和层析方法纯化后,用Western-bloting和ELISA分析其抗原性。SDS-PAGE显示,重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段以完全可溶性形式在大肠杆菌中得到高效表达;用Ni+-NTA树脂亲和层析方法纯化,获得了较高纯度的重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段;Western-blotting显示,该重组肽段对赤羽病病毒阳性血清具有很强的反应原性。本研究表达、纯化和鉴定了具有强抗原性的重组rHis-Gc_(405aa—480aa)肽段,为进一步开展Gc蛋白单克隆抗体制备、B细胞表位鉴定和诊断试剂研制奠定了基础。     

牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因克隆、原核表达及免疫保护效果研究

为了分析牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK重组蛋白的免疫效果,试验采用RT-PCR方法克隆出牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-Sjp38MAPK,转化到BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western-blot方法检测其蛋白的表达情况。结果表明,获得约为55 ku的重组蛋白rSjp38MAPK,表达的重组蛋白Sjp38MAPK能被感染日本血吸虫的阳性血清识别,具有免疫原性。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,以临床分离的日本血吸虫尾蚴腹部贴片攻毒,发现重组蛋白免疫组能降低小鼠的减虫率和肝脏减卵率,可诱导产生特异IgG抗体,具有较好免疫保护效果。这为进一步研究Sjp38MAPK蛋白功能及研制基因疫苗奠定基础。     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

弓形虫胶体金免疫层析试纸条的研制

为了研制一种可用于检测弓形虫的快速诊断胶体金免疫层析试纸条,本研究对弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)SAG1和SAG2的基因片段进行重构合成,与PET-28a(+)载体连接后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,获得SAG重组表位抗原,Western blot对重组蛋白免疫原性进行分析。用r SAG重组蛋白及r SPG分别划线,作为检测线和质控线,制作胶体金免疫层析试纸条,利用小鼠弓形虫阳性血清及小鼠阴性血清检验胶体金免疫层析试纸条检查效果。本研究成功表达纯化了SAG抗原表位的重组蛋白,且该重组蛋白具有较好的免疫原性。以此多抗原表位的重组蛋白作为检查抗原研制了胶体金免疫层析试纸条,能够快速检测弓形虫的阳性血清,为基层弓形虫病的快速诊断奠定了基础。     

新型抗菌肽Hadrurin基因的克隆与表达

Hadrurin是一种分离自毒蝎的高活性抗菌肽,对多种细菌有较强抑制活性.本试验构建Hadrurin全基因并在其两端加入了可切除的保护性多肽基因;再酶切Hadrurin基因产生黏性末端并连入pET-32a(+)原核表达载体;IPTG诱导表达抗菌肽蛋白,亲和层析纯化抗菌肽蛋白.结果表明,构建的Hadrurin全基因片段序列完全正确,连接进入pET-32a(+)表达载体的基因由0.1 mmol/L终浓度的IPTG诱导5 h可达到表达的高峰,重组蛋白经亲和层析可到达纯化的目的.     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。