鸡新城疫病毒的分离鉴定与交叉免疫保护试验

为了评价疫苗免疫保护效果,进而筛选出最佳的免疫方案,将分离到的鸡新城疫病毒(Newcas-tle disease virus,NDV)流行毒株制备成灭活疫苗进行交叉免疫保护试验研究。把采集到的疑似发生新城疫的病鸡肺、气管环等组织经处理后接种10日龄SPF鸡胚进行病毒的分离和增殖,并用血清学和分子生物学方法进行毒株的鉴定;用分离到的NDV/Chicken/TC/1/2011毒株制成油乳剂灭活苗,与La Sota疫苗以不同的疫苗组合免疫SPF鸡,进行交叉免疫保护试验。结果显示,共分离到9株新城疫病毒,其F蛋白裂解位点的氨基酸均为112 R-R-Q-K-R-F117,表现为强毒株的分子特征,与致病指数结果一致。分离株灭活苗组和分离株灭活苗+La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最高,其次是La Sota灭活苗+La Sota弱毒苗和LaSota灭活苗,La Sota弱毒苗对试验鸡的免疫保护力最低。NDV分离株与疫苗株La Sota存在明显抗原性差异,这将对新城疫疫苗的发展和疾病控制策略制定至关重要。     

两种新城疫灭活疫苗免疫原性比较

新城疫作为家禽养殖业危害最大的疫病之一,近些年来常发生免疫失败的现象,究其原因,由于免疫压力的增大和变异株的增多,使疫苗的免疫效果受到极大的挑战,因此选择合适的病毒株制备疫苗对免疫效果具有重要的意义。论文通过测定抗体水平比较新城疫基因Ⅶ型A-Ⅶ株和传统基因Ⅱ型La Sota株油乳剂灭活疫苗对鸡只免疫效价的影响,通过攻毒后的保护、排毒情况及病毒载量的研究,综合比较了2种毒株的免疫原性。通过本试验发现,利用基因Ⅶ型A-Ⅶ株灭活苗与基因Ⅱ型La Sota株灭活苗免疫SPF鸡后,A-Ⅶ株灭活苗所产生的HI抗体效价明显高于La Sota株灭活苗。而通过基因Ⅶ型YND株和标准强毒F48E9株攻毒试验结果显示,2种疫苗均能100%的保护鸡只不死亡,但A-Ⅶ株比La Sota株灭活苗能够更好地抑制强毒在体内的复制和排毒。由此可见,基因Ⅶ型A-Ⅶ株对不同基因型强毒的抵抗能力优于基因Ⅱ型La Sota株,具有更好的免疫原性,通过本试验可为新城疫的防控选择合适的疫苗提供一定的参考。     

一株Ⅶb型新城疫病毒的生物学特性研究

本研究对2013年新分离的一株鸡源新城疫病毒(NDV)(P1125)进行了致病指数测定、F基因测序和遗传进化分析,并对La Sota疫苗免疫的保护效力进行了评价。结果显示,该分离株致死鸡胚平均死亡时间为44 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.988,6周龄雏鸡静脉接种致病指数为2.71。F基因测序表明其编码区长度为1 662 bp,共编码553个氨基酸,F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有NDV强毒典型的分子特征,HN蛋白由571个氨基酸残基组成,属于C类NDV,表明该分离株为强毒株。遗传进化分析表明该分离株属于Ⅶb亚型。同源性分析显示该分离株与La Sota氨基酸相似率为88.4%。免疫保护试验表明,La Sota灭活疫苗能够对该分离株标准剂量攻击提供临床保护,但在攻毒1 d、3 d、5 d后均可以检测到排毒现象。本研究为研制专门针对我国流行株的新城疫新型疫苗及我国新城疫的防控具有重要意义。     

新城疫病毒SXFP株的分离鉴定及油乳剂灭活苗免疫效果评价

从陕西富平某种鸡场发病鸡群中分离出了1株流行毒株,经HA-HI试验和动物回归试验,确定分离到的为NDV,命名为SXFP株.经过测定,SXFP株鸡胚半数致死量(ELD50)为109.0/0.1 mL;鸡胚最小致死量的平均致死时间(MDT)为52.3h;对1日龄SPF雏鸡脑内致病指数(ICPI)为1.92,提示SXFP株为强毒力株.血清交叉反应试验显示,SXFP株和La Sota株存在小的抗原性差异.用SXFP株油乳剂灭活苗对SXFP株和La Sota株的保护率分别为90%和100%,明显优于La Sota株油乳剂灭活苗的60%和70%.提示SXFP株制备的疫苗对流行毒株和经典毒株均能很好地保护.     

一株鸡新城疫病毒的分离鉴定及其油乳剂灭活苗免疫效果评价

从河南某种鸡场发病鸡群中分离出1株毒株,经HA、HI和动物回归试验,确定分离的病毒为NDV,命名为HNYD株。经过测定,HNYD株鸡胚半数致死量（ELD50）为10^90/0．1mL;鸡胚最小致死量的平均致死时间（MDT）为53．8h;对1日龄SPF雏鸡脑内致病指数（ICPI）为1．86,提示HNYD株为强毒力株。血清交叉反应试验显示HNYD株和La Sota株存在一定的抗原性差异。用HNYD株油乳剂灭活苗对HNYD株和La Sota株的保护率分别为90％和100％,明显优于La Sota株油乳剂灭活苗,提示HNYD株制备的疫苗对流行毒株和经典毒株的攻击均能很好的保护。     

4株新城疫病毒株的分离与鉴定

对近三年采集的213份临床样品进行了新城疫病毒的分离与鉴定,得到4株NDV分离株,其中3株来源于鸡,1株来源于鸭。通过RT-PCR方法对毒株的F和HN基因进行了扩增与序列测定,与Gen Bank中的NDV序列进行了同源性和遗传进化分析,并测定了其致病指数。结果显示:HB0601和HB0804株为强毒株,属于基因Ⅶb亚型,其F基因与Chicken-Jiangxi-07-2009同源性最高,为99.5%和99.7%,与La Sota株的同源性为82%。SC1805和HB1906为弱毒株,属于基因Ⅰ型,其F基因与Chicken-Colombia-1326-14475-2009同源性最高,分别为99.8%和99.9%,与La Sota株的同源性为89%。4株NDV分离株与传统疫苗株的遗传进化关系较远。研究为ND的防控及分子流行病学研究提供了数据支撑。     

新城疫病毒弱毒株对鹅的免疫效力试验

用新城疫病毒(NDV)疫苗株La Sota和NDV基因Ⅶ型致弱株AND/Ⅶ为免疫原,分别以活苗和灭活苗的形式免疫2周龄试验鹅,免疫后第7、14天和21天采血分离血清用于抗体效价测定.免疫后3周以基因Ⅶ型强毒分离株JS2-06进行攻毒,攻毒后每天观察各组鹅的发病情况,并于第2、4天和7天分别采集喉气管和泄殖腔棉拭样品,用于病毒的分离.试验结果表明,活疫苗免疫后不能产生有效的免疫应答,而灭活苗免疫鹅对强毒的感染具有较强的抵抗能力,但基因Ⅶ型致弱株AND/Ⅶ能更有效抑制鹅体的排毒,其免疫效力明显高于疫苗株La Sota.     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株(La Sota等)的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段(登录号:JF950510.1)设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDVF基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉致病指数(IVPI)判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列(登录号:JF950510.1)设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

鸡新城疫的流行与免疫

门诊病例统计表明，我国鸡群中ND的发病率仍非常普遍。近些年来，世界各地对NDV分离株的研究结果发现，其HN基因和F基因序列的某些位点发生的变化，致使毒株间的毒力差异较大，抗原性亦有差异，但其主要抗原表位未发生变化。山东家禽研究所禽病室对1998－1999年的6个NDV分离株做了比较研究，各毒株的毒力不同且都比经典的F48E9强，其中二个属基因Ⅶ型。但交叉免疫保护试验表明，用La Sota株弱毒苗及其灭活油乳苗免疫的鸡，在用这6个分离毒分别攻毒后，均有1005保护率。同样，用这6个分离毒制成的灭活油乳苗免疫鸡后，对经典毒E48F9亦产生100％保护率。这表明，从目前发病鸡群中分离的NDV毒株与La Sota弱毒株、标准F48E9强毒株间有很好的交叉免疫保护作用。     

鸡新城疫不同毒株间的交叉保护性研究

将NDV－La Sota疫苗株、NDV山东地方强毒株CY和DY以及NDV F48E8标准强毒株分别制成油乳剂灭活疫苗，免疫6周龄SPF鸡，然后分别用分离强毒株和F48E8强毒株进行攻击。结果发现，两个分离毒株之间、分离毒株与标准毒株之间、IV系疫苗株与分离毒株之间都可以得到完全交叉保护。     

鸡新城疫不同毒株间的交叉保护性研究

将NDV－La Sota疫苗株、NDV山东地方强毒株CY和DY以及NDV F48E8标准强毒株分别制成油乳剂灭活疫苗，免疫6周龄SPF鸡，然后分别用分离强毒株和F48E8强毒株进行攻击。结果发现，两个分离毒株之间、分离毒株与标准毒株之间、IV系疫苗株与分离毒株之间都可以得到完全交叉保护。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

新城疫分离株疫苗免疫保护试验

用经过鉴定的新城疫病毒分离株按国家兽医生物制品质量标准制备油乳剂灭活疫苗，与标准的La Sota疫苗分别免疫带有新城疫母源抗体的白来航鸡，免疫后每7d采血监测新城疫抗体，并于免疫后21，28，35d用鸡新城疫分离毒和F48E9分别进行人工感染试验。结果显示，分离株灭活苗对鸡新城疫分离株的免疫保护效力优于La Sota灭活苗。     

12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株做遗传进化分析。12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型。F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6%~91.5%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8%~99%之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9%~91.9%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84%~98.5%之间。氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控。     

鸡新城疫病毒分离株与La Sota株灭活疫苗效力比较试验

用NDV分离株及La Sota株为抗源液，经福尔马林灭活后，与油佐剂混合，分别制成分离株灭活苗、La Sota株灭活苗及分离株与La Sota株二价灭活苗。将这三种灭活疫苗分别免疫SPF鸡后，均获得100%抵抗NDV分离株及F48株强毒攻击的保护力；而用这3种灭活苗与La Sota活苗单独或联合使用，免疫带有ND母源抗体的普通鸡后，3种灭活苗的免疫效力不同，分离株灭活苗与价灭活苗对NDV分离株攻击的免疫保护效力明显优于La Sota灭活苗；灭活苗与活苗同时使用，其免疫效力明显优于单独使用灭活苗或活苗。     

六株鸽源新城疫病毒的分离、鉴定及生物信息学分析

新城疫是严重危害世界养禽业的一种禽类传染病。近年来,鸽新城疫的流行越来越严重,引起了养殖户和兽医工作者的广泛关注。本研究在4批发病鸽组织病料中分离到了4株鸽源新城疫强毒株和2株鸽源弱毒株。病毒分离株经鸡胚有限稀释法纯化5次后,新鲜尿囊液用于提取病毒RNA。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。通过对F基因的遗传进化分析发现,4株鸽源强毒株属于ClassⅡ基因Ⅵb亚型,2株鸽源弱毒株与Class II基因II型疫苗株La Sota高度同源。进一步遗传进化分析结果显示,4株鸽源新城疫病毒强毒株与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与欧洲流行株亲缘关系十分相近,而与中国20世纪90年代鸽源分离株遗传距离稍远,因此推测当前鸽源流行强毒株可能源自欧洲。生物信息学分析显示鸽源毒株HN蛋白345~353位的一个线性抗原表位发生了改变,而血清学实验显示La Sota疫苗株和鸽源毒株的交叉血凝抑制存在明显差异,暗示鸽源毒株已经发生了抗原性变异。因此,使用鸡疫苗株La Sota免疫鸽存在免疫失败的风险,需要研发鸽专用新城疫病毒疫苗用于鸽新城疫的防疫工作。     

强毒鸡新城疫病毒的分离鉴定及免疫防制研究

从陕西发病鸡群中分离出8株病毒，分离毒大多为速发型NDV强毒株，对经典NDV La Sota株免疫的雏鸡及52周龄高抗体母鸡仍有强的致病力，采用NDV SH1－SH8病株制备成多价油乳剂灭活苗，免疫鸡群有良好的保护力。     

鹭源新城疫病毒的生物学与遗传学特性研究

对2013年从健康野生鹭科候鸟中分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)蚀斑纯化后,选择5株病毒进行了生物学鉴定和遗传进化分析。致病指数和脑内接种指数测定结果显示5个分离株均为弱毒株;F蛋白裂解位点处氨基酸序列均为112ERQERL117,具有典型的弱毒株特征。交叉HI试验结果发现ClassⅠ分离株与La Sota的HI抗原同源性为0.56~0.57,与ClassⅡ强毒株的HI抗原同源性为0.44~0.51;遗传进化分析发现5个NDV毒株与目前流行的强毒株遗传关系较远,均属于ClassⅠ3c亚型,表明健康鹭携带I类新城疫病毒,在迁飞的过程可能传播给家养水禽,对其构成潜在威胁,提示加强野鸟NDV的监控及流行病学研究具有紧迫性和重要性。     

鹅源新城疫病毒的分离及生物学特性研究

取山东某地病死鹅的脑和脾脏常规处理,分别接种11日龄SPF鸡胚和16日龄非免疫鹅胚,从死亡胚的尿囊液中分离到毒株,并对分离株进行了血凝性鉴定、毒力鉴定、动物试验以及疫苗保护试验。结果表明:该毒株具有血凝性,为强毒株,血凝性能被新城疫病毒(NDV)阳性血清所抑制,且其他生物学特性与NDV也有很大的相关性,故将其命名为NDVWF216株。用分离的鹅源新城疫病毒WF216株尿囊液制成油乳剂灭活苗和NDV油乳剂灭活苗均可保护鹅和鸡免受鹅源新城疫强毒的攻击。     

鸡新城疫及传染性法氏囊病二联油乳剂灭活苗的试制与应用

应用新城疫 ( ND)疫苗株 I系及 La Sota株、传染性法氏囊病 ( IBD)疫苗株 B87及自然强毒株制备成二联油乳剂灭活苗 ,通过免疫试验及区域试验 ,结果表明 ,疫苗安全可靠 ,免疫原性强 ,免疫鸡群一周后产生免疫力 ,3周后产生坚强免疫力 ,获得良好保护。受到用户好评。1　材料与方法