重组鸡α干扰素抑制H9N2禽流感病毒在鸡胚中增殖的研究

为检测重组鸡α干扰素(rChIFN-α)抑制H9N2禽流感病毒(AIV)在鸡胚中的增殖效力,本研究将rChIFN-α按其抗病毒效价高低分为4个组(10~7 U/mL、10~6 U/mL、10~5 U/mL和10~4 U/mL),同时设置阴性对照组和病毒对照组。各实验组再依次按照给药时间不同又分为"先给药再接种病毒组"、"同时给药和接种病毒组"及"先接种病毒再给药组"3个小组进行试验,通过检测H9N2 AIV血凝效价的变化、H9N2 AIV HA基因拷贝数以及各组EID_(50)评价rChIFN-α对H9N2 AIV增殖抑制效力。结果显示,除低剂量组以外,各剂量组与病毒对照组相比,结果均可以显著降低鸡胚尿囊液中H9N2 AIV的血凝效价(p0.01),同时能够显著减少H9N2 AIV基因的拷贝数(p0.01)及显著降低EID_(50)(p0.01)。表明中等剂量(10~5 U/mL)及更高剂量的rChIFN-α在鸡胚中能够显著抑制H9N2 AIV的增殖。本研究为rChIFN-α今后在临床中抗AIV治疗的实际应用提供了相关实验依据。     

海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用

为探讨海藻硫酸多糖(sulfated polysaccharide from algae,SPA)及中药复方提取液(compound extracts of Chinese medicine,CECM)对H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价(P0.01),以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组(200mg/mL)的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组(12.5、25和50mg/mL)及CECM低、中剂量组(50和100 mg/mL)(P0.05);治疗作用组,SPA高剂量组(50 mg/mL)及CECM中、高剂量组(100和200mg/mL)抗病毒效果显著优于SPA低剂量组(12.5mg/mL)(P0.05);直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著(P0.01)。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。     

悬浮培养和鸡胚尿囊液抗原制备的H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较试验

为了探讨悬浮培养和鸡胚尿囊液培养得到的H9亚型禽流感病毒(AIV)抗原制备的疫苗的免疫效力,试验用3株H9亚型AIV株分别接种微载体悬浮培养的MDCK细胞制备3种悬浮培养的细胞疫苗抗原,以3株H9亚型AIV株接种10日龄SPF鸡胚制备3种鸡胚尿囊液抗原,测定6种抗原液HA效价和鸡胚半数感染量(EID50);分别使用6种抗原液制备灭活疫苗,免疫21日龄SPF鸡,并在免疫后第21天采血测定HI抗体水平,采血后进行攻毒并在攻毒后第5天进行病毒分离试验。结果表明:两种方式制备的AIV抗原HA效价为7~9 lb,鸡胚半数感染量为1×106.9~7.9EID50,疫苗免疫后第21天用同源毒株作为工作抗原测定的免疫鸡HI效价差异不大,用异源毒株测定时有一定差异;两种方法得到的抗原制备的疫苗均能获得很好攻毒保护。     

2株H7N9亚型重组禽流感病毒的生物学特性和免疫原性研究

为评估经反向遗传构建的H7N9亚型重组禽流感病毒(AIV)H7-Re1株和H7-Re2株的生物学特性及免疫原性,本研究将这2株病毒分别以104倍稀释接种10日龄SPF鸡胚后,36℃培养,观察鸡胚存活情况并检测病毒HA效价,结果显示96 h时,2株病毒接种的鸡胚全部存活,培养至72 h时其HA效价均为9 log2,均显著高于亲本分离株。测定2株病毒的静脉内接种致病指数(IVPI),结果显示均为0。将2株病毒分别以10~6EID_(50)剂量鼻腔内接种5周龄SPF鸡,进行致病性试验,结果显示,接种后14 d内,2株病毒接种鸡均无临床症状,也不排毒。以2株病毒为种毒分别制备油乳剂灭活疫苗,以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡后3周时检测免疫鸡血清中HI抗体,结果显示,两种疫苗免疫鸡平均HI效价均可达到8.0 log2。于免疫后21 d,H7-Re1株免疫组鸡分别攻击10~6EID_(50)的H7N9亚型低致病力AIV(PG/SHH/S1069/13株)和10~5EID_(50)的高致病力AIV(CK/GX/SD098/17株),进行攻毒试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均全部存活,且无发病和排毒出现。H7-Re2株免疫组鸡于免疫后21 d分别以10~5EID_(50)的剂量进行高致病力H7N9亚型AIV(CK/GX/SD098/17株)和H7N2亚型AIV(DK/FJ/SE0195/18株)的攻毒保护试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒。以上结果表明,以H1N1亚型A/Puerto Rico/8/34株病毒为内部基因供体、经反向遗传学方法构建的H7-Re1株和H7-Re2株均具有生长滴度高、生物安全性高和免疫原性好的特点。本研究为H7N9亚型禽流感疫苗的研制和应用奠定了基础。     

海藻硫酸多糖和中药复方对鸡胚接种H9N2亚型禽流感病毒的作用

为探讨海藻硫酸多糖（sulfated polysaccharide from algae,SPA）及中药复方提取液（compound extracts of Chinese medicine,CECM）对H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的作用,将SPA及CECM以3种不同加药方式作用于接种了H9N2亚型AIV的10日龄SPF鸡胚中,无菌收集鸡胚尿囊液,测定血凝效价,检测2种药液对H9N2亚型AIV的预防、治疗及直接灭活作用。结果显示,SPA及CECM的最大安全浓度分别为50和200 mg/mL;3种不同加药方式下,不同浓度SPA及CECM均能极显著降低鸡胚尿囊液中H9N2亚型AIV的血凝效价（P<0.01）,以直接灭活作用组的血凝效价降低幅度最大,预防作用组和治疗作用组次之。预防作用组,CECM高剂量组（200 mg/mL）的抗病毒效果显著优于SPA各剂量组（12.5、25和50 mg/mL）及CECM低、中剂量组（50和100 mg/mL）（P<0.05）;治疗作用组,SPA高剂量组（50 mg/mL）及CECM中、高剂量组（100和200 mg/mL）抗病毒效果显著优于SPA低剂量组（12.5 mg/mL）（P<0.05）;直接灭活作用组,SPA及CECM的抗病毒效果均佳,CECM各剂量组的抗病毒效果与SPA各剂量组差异极显著（P<0.01）。结果表明,SPA和CECM对10日龄鸡胚几乎无毒副作用;SPA及CECM均能显著抑制H9N2亚型AIV在鸡胚尿囊液中的增殖,以直接灭活作用组的抗病毒效果最佳,其抗H9N2亚型AIV作用的强弱与药物浓度、用药和病毒的感染时间顺序密切相关。     

新城疫、禽流感病毒同胚培养制备二联灭活疫苗工艺研究

基于新城疫病毒(NDV)LaSota株、禽流感病毒(AIV)SS株均可通过鸡胚接种增殖的特点,将2种病毒按一定比例稀释后混合接种鸡胚尿囊腔,一定条件下进行2种病毒的同胚培养。试验通过检测红细胞凝集试验(HA)、半数感染量(EID_(50))以及血清抗体效价检测等对培养产物进行评价。结果表明,2种病毒均可在鸡胚内增殖,最终选用10 000倍稀释的SS株与200倍稀释的LaSota株混合后,以0.1 mL/个接种于10日胚龄鸡胚,37℃培养96 h后收获。经半数致死量检测得LaSota株的EID_(50)为10~(7.5)/0.1 mL,SS株的EID_(50)为10~(7.63)/0.1 mL略低于单独接种的EID_(50)。结果表明,试验使用SS株与LaSota株按10 000:200稀释条件可以实现同胚培养,证明SS株对La Sota株的增殖具有干扰作用,但在一定条件下可以实现同胚培养。本研究为同胚接种制备二联疫苗提供科学依据。     

H6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析

为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。     

NDV和H9亚型AIV在血凝抑制及混合病毒在鸡胚增殖中的相互干扰

先测定NDV强、弱毒毒株和H9AIV毒株的血凝(HA)效价,并用血清分别作血凝抑制(HI)试验。将测定好的病毒液按不同比例混合,测定HA效价及血清对其抑制效价后接种SPF鸡胚。收获死胚尿囊液后测定HA、HI效价。结果显示,H9AIV和NDV之间存在比较严重的干扰现象。     

中药制剂"瘟毒杀"对IBDV、NDV和AIV的抑制试验

选10日龄SPF鸡胚,进行了瘟毒杀煎液对鸡胚人工感染NDV、IBDV和AIV抑制试验.结果显示,瘟毒杀药液(1g/ml)2倍、4倍和6倍稀释,对感染NDV强毒的鸡胚保护率达到100%、75%和62.5%,比NDV强毒对照组分别提高87.5、62.5和50个百分点;对感染AIV强毒的鸡胚保护率达到87.5%、62.5%和50%,比AIV强毒对照组分别提高75、50和37.5个百分点;对感染IBDV强毒的鸡胚保护率达到100%、87.5%和62.5%.比IBDV强毒对照组分别提高75、62.5和37.5个百分点.NDV强毒接种组鸡胚尿囊液NDV血凝效价极显著高于NDV强毒+瘟毒杀药液组尿囊液NDV血凝效价;AIV强毒接种组鸡胚尿囊液AIV血凝效价极显著高于AIV强毒+瘟毒杀药液组尿囊液AIV血凝效价.结果表明,瘟毒杀对NDV、AIV和IBDV有较强的抑制作用.     

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV) HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定.结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长.单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞.研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现.S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用.这提示该病的防控面临着新的挑战.     

60Coγ射线对新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活研究

用⁶⁰Coγ射线对不同状态不同体积的鸡新城疫病毒(NDV)、H9N2亚型禽流感(H9N2 AIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行辐照,研究⁶⁰Coγ射线对灭活疫苗中病毒的灭活效果。结果表明,6.0 kGy ⁶⁰Coγ射线辐照对冷冻和液态下5000和10000 mL的NDV、H9N2亚型AIV和PRRSV均不能灭活,辐照后NDV和H9N2亚型AIV冷冻尿囊液的HA效价降低而液态尿囊液的HA效价升高;液态下,⁶⁰Coγ射线能够灭活250 mL细胞培养液中的PRRSV,不能灭活250、5000和10000 mL尿囊液中的NDV和H9N2 AIV,250 mL与5000、10000 mL的NDV HA效价间差异显著(P＜0.05)。⁶⁰Coγ射线辐照对液态的PRRSV细胞培养液灭活效果良好,有望用于灭活苗的病毒灭活。     

中药金丝桃素注射液对鸡新城疫病毒抑制作用研究

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药金丝桃素注射液对鸡新城疫病毒的抑制作用。试验共分4组,第Ⅰ组接种病毒尿囊液与中药金丝桃素混合液,HA滴度0。第Ⅱ组接种病毒尿囊液与西药金刚烷胺混合液,HA滴度5log2。第Ⅲ组接种病毒尿囊液与生理盐水混合液,HA滴度9log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度0。结果表明,中药金丝桃素注射液对鸡胚无毒性作用。中药金丝桃素与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制鸡新城病毒在鸡胚中增殖。     

中药蟾甘口服液鸡胚接种抗鸡新城疫病毒研究

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药蟾甘口服液对鸡新城疫病毒的抑制作用。试验共分4组,第Ⅰ组接种病毒尿囊液与中药蟾甘口服液混合液,HA滴度0。第Ⅱ组接种病毒尿囊液与西药金刚烷胺混合液,HA滴度5log2。第Ⅲ组接种病毒尿囊液与生理盐水混合液,HA滴度9log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度0。结果表明,中药蟾甘口服液对鸡胚无毒性作用。中药蟾甘口服液与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制鸡新城病毒在鸡胚中增殖。     

中药泽漆注射液鸡胚接种抗鸡新城疫病毒研究

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药泽漆注射液对鸡新城疫病毒的抑制作用.试验共分4组,第Ⅰ组接种病毒尿囊液与中药泽漆混合液,HA滴度为0;第Ⅱ组接种病毒尿囊液与西药金刚烷胺混合液,HA滴度为4loga;第Ⅲ组接种病毒尿囊液与生理盐水混合液,HA滴度为8log2;第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度为0.结果表明,中药泽漆注射液对鸡胚无毒性作用.中药泽漆与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制鸡新城病毒在鸡胚中增殖.     

中药虎杖注射液鸡胚接种抗鸡新城疫病毒研究

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药虎杖注射液对鸡新城疫病毒的抑制作用。试验共4组,第Ⅰ组接种病毒尿囊液与中药虎杖混合液,HA滴度0。第Ⅱ组接种病毒尿囊液与西药金刚烷胺混合液,HA滴度4log2。第Ⅲ组接种病毒尿囊液与生理盐水混合液,HA滴度7log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度0。结果表明,中药虎仗注射液对鸡胚无毒性作用。中药虎杖与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制鸡新城疫病毒在鸡胚中增殖。     

中药组方鸡胚接种对鹅副粘病毒的抑制试验

选用中药组方对10日龄鸡胚进行药物毒性试验(第1组)和鹅副粘病毒抑制试验(第2组)。其中,第2组分为试验Ⅰ组(接种病毒尿囊液与中药组方混合液)、试验Ⅱ组(接种病毒尿囊液与西药利巴韦林混合液)、试验Ⅲ组(接种病毒尿囊液与生理盐水混合液)、对照组(不接种病毒尿囊液,不给药),并进行红血球凝集(HA)试验。结果:中药组方接种鸡胚无死亡;试验Ⅰ组HA滴度为0,试验Ⅱ组HA滴度为5 log2,试验Ⅲ组HA滴度为9 log2,对照组HA滴度为0。结果表明:中药组方对鸡胚无毒副作用;中药组方与病毒尿囊液同时接种鸡胚,能完全抑制鹅副粘病毒在鸡胚中增殖。     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

中药炎康注射液对伪狂犬病病毒的抑制试验

用鸡胚培养法和红血球凝集(HA)试验,测定中药炎康注射液对伪狂犬病病毒的抑制作用。试验共分4组:第Ⅰ组同时接种病毒尿囊液与中药炎康混合液,HA滴度为0。第Ⅱ组同时接种病毒尿囊液与西药金刚烷胺混合液,HA滴度为4 log2。第Ⅲ组同时接种病毒尿囊液与生理盐水混合液,HA滴度为7 log2。第Ⅳ组不接种病毒尿囊液,不给药,HA滴度为0。结果表明,中药炎康注射液对鸡胚无毒性作用;中药炎康与病毒同时接种鸡胚,能完全抑制伪狂犬病病毒在鸡胚中增殖。     

H9N2亚型禽流感病毒糖基化位点突变株的构建与生物学特性研究

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白第200位N-糖基化位点的功能,利用流感病毒8质粒反向遗传系统拯救出重组病毒r-WZP株(缺失HA基因第200位N-糖基化位点)和r-WZP200株(含有HA基因第200位N-糖基化位点)。两株病毒的内部基因来自病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1),HA基因与NA基因均来自H9N2AIV流行毒株。结果表明,两株病毒均能够在SPF鸡胚中稳定增殖,这一位点的缺失致使病毒与鸡红细胞的结合能力下降,HA效价热稳定性提高,对SPF鸡胚的致死能力增强,对进一步研究H9N2亚型AIV HA蛋白N-糖基化位点的功能具有重要的参考价值。     

1株H6N6亚型禽流感病毒贵州分离株HA和NA基因克隆与序列分析

为了解 H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的流行情况,本研究对2014年从贵州省三穗鸭体内分离鉴定出的1株H6N6亚型AIV (A/duck/Guizhou/013/2014) HA和NA基因进行了克隆和序列分析。结果显示,A/duck/Guizhou/013/2014的HA基因与华东地区2009年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达97.5%,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性AIV的分子特征;而NA基因则与福建2007年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达98.2%;由遗传进化树分析结果可知,HA和NA基因在遗传进化关系上,与湖南毒株位于同一分支,而与2007年贵州分离的3株H6N6亚型AIV不处于同一分支,说明A/duck/Guizhou/013/2014与本地区的H6N6亚型AIV亲缘关系较远。本研究结果表明当前贵州地区H6N6亚型AIV存在明显的遗传多样性。