副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的B细胞抗原表位鉴定

副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5能诱导机体产生免疫保护反应,同时可以用于特异性的血清学诊断,本试验选取P5蛋白进行抗原表位鉴定。首先通过PCR扩增P5F1(1²04aa),P5F2(170204aa),P5F2(170²96aa)及P5F3(280296aa)及P5F3(280³71aa)3个片段,PCR产物分别定向克隆到表达载体pET32a(+)中表达纯化。根据ELISA和Western blotting结果确定P5F3片段(280-371aa)是Omp P5的免疫优势决定区。为了进一步对该免疫优势决定区进行抗原表位鉴定,设计了一套11个部分重叠的短肽,这些短肽覆盖全部280371aa)3个片段,PCR产物分别定向克隆到表达载体pET32a(+)中表达纯化。根据ELISA和Western blotting结果确定P5F3片段(280-371aa)是Omp P5的免疫优势决定区。为了进一步对该免疫优势决定区进行抗原表位鉴定,设计了一套11个部分重叠的短肽,这些短肽覆盖全部280³71aa片段。每一个短肽合成1对寡核苷酸链,退火后插入表达载体pGEX-6p-1,与GST进行融合表达。用HPS阳性血清进行ELISA和Western blotting扫描,鉴定出其表位位于336 TGNTCDAVKGRKALIT351。通过序列分析证实该抗原表位在不同的HPS菌株中高度保守。本试验确定了位于HPS Omp P5上的一个抗原表位,为建立一种方便、快捷、适用于现地大规模样品检测的鉴别诊断方法奠定了基础,同时也为HPS新型亚单位疫苗的研制,以及研究病原菌感染和机体免疫过程中P5蛋白与宿主体内相应分子之间的相互作用提供了有用信息。     

鹅细小病毒VP3蛋白B细胞线性表位的精确定位

本试验旨在利用获得的4株抗鹅细小病毒(GPV)VP3的单克隆抗体,进一步对GPV VP3 B细胞线性抗原表位精确定位。根据笔者实验室已鉴定的线性抗原表位区结果,筛选出单抗所针对的优势抗原表位区。设计并合成互相重叠5 aa的10 aa短肽寡聚核酸片段,退火后,连入pET-32a载体,经转化鉴定,诱导表达后,获得相应的小片段融合蛋白,并利用单抗通过Western blot进行抗原性鉴定。同样方法进行短肽片段两端氨基酸的逐个缺失设计,进一步精确定位,结果鉴定出2个抗原表位,分别为430-435 aa和643-647 aa。     

噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

为了研究副猪嗜血杆菌（HPS）外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和West—ernblot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。     

La Sota与V4疫苗F蛋白的B细胞表位活性检测与比较

根据La Sota 和V4疫苗株F蛋白B细胞表位预测的结果,进行了表位区的鉴定和比较.将两疫苗株F基因预测存在差异的表位,根据序列位置邻近合并分成6段表位区,分别对每个毒株的6段表位区进行了亚克隆,并对每个毒株的预测区进行了表达.应用建立的Tricine缓冲体系50 g/L～200 g/L线性梯度聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳对表达情况进行了分析,得到5段多肽的大小分别是P1为8.0 ku,P2为10.8 ku,P4为11.6 ku,P5为13.5 ku,P6为10.5 ku.应用La Sota特异性抗血清,利用Western blotting对表达的各肽段进行了抗原性鉴定.结果表明,P1、P4、P5、P6段呈阳性反应,说明其中含有线性B细胞表位.这4段分别位于F蛋白的1 aa～48 aa,201 aa～274 aa,377 aa～458 aa和469 aa～530 aa,以前发现的中和性表位均不在这4段区域内.而P2段在Western blotting中无抗体反应性,表明它不含线性表位.比较研究发现NDV La Sota与V4株的P4区的B细胞表位活性存在着重要的差异,这种差异可能造成两个毒株的免疫原性差异.     

Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定

为了对Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个VP2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达.用Asial型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出VP2蛋白B细胞线性抗原表位位于氨基末端的第1-44氨基酸区域,并且证实O型、A型、C型口蹄疫标准血清和感染SAT2型口蹄疫康复期的牛血清也能识别融合蛋白F1(1-44 aa).在此基础上,针对F1(1-44 aa)短肽,设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了VP2蛋白B细胞线性表位位于氨基末端的第6-15氨基酸区域.     

猴免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体结合抗原表位的鉴定

为鉴定抗猴免疫缺陷病毒(SIV)衣壳蛋白p27单克隆抗体(MAb) p27-A5、p27-C7和p27-D2所识别的抗原表位,本研究通过间接ELISA法相加试验对这3株MAbs结合抗原表位进行初步分析,并利用部分重叠的短肽对MAbs的结合抗原表位进行鉴定.结果表明p27-C7和p27-A5的结合抗原表位位于p27蛋白的aa61～aa76(氨基酸序列为61SEGCTPYDINQMLNCV76);p27-D2的结合抗原表位则位于aa191～aa206(氨基酸序列为191EQTDAAVKNWMTQTLL206).该结果为进一步深入了解p27的抗原特性和建立该蛋白的检测方法奠定了基础.     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原优势区域的鉴定

流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis,JE）是一种人与动物共患的虫媒病毒性疾病,严重危害着人畜的健康。E蛋白是乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。为了确定该蛋白的抗原优势区域,本研究设计了3对引物,将E蛋白分成3个大段,分别是EF1（1～291aa）、EF2（292～402aa）和EF3（403-500aa）,又将EF1分成4个相互重叠的小片段,分别是EF1-1（1～88aa）、EF1—2（68～155aa）、EF1—3（129～222aa）和EF1—4（202～291aa）,将以上基因片段分别克隆到原核表达载体进行GST融合表达。SDS-PAGE电泳鉴定各融合蛋白均获得表达,各表达产物以包涵体的形式存在。通过Western blot分析表明融合蛋白GST-EF1、GST—EF2、GST—EF1—1、GST-EF1-2、GST—EF1—3和GST—EF1～4均能被阳性血清识别。通过ELISA鉴定,GST-EF2反应性最强,GST-EF1反应性比GST-EF2稍弱,而GST-EF3反应性最弱,GST-EF1-1、GST-EF1—2、GST-EF1—3和GST—EF1—4片段融合蛋白反应性与GST—EF1相似。由此本研究鉴定出1-402aa是E蛋白的抗原优势区域,在此区域内包括了12个Cys的保守区及域Ⅰ、域Ⅱ和域Ⅲ3个主要抗原域。E蛋白抗原优势区域的鉴定,为E蛋白抗原表位的鉴定以及针对于E蛋白诊断试剂的开发奠定了基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV）HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2（Nonstnduralprotein2）蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11（^749KGEPvsdqpak^759）能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变（S754）处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸（^754SDQPAK^759）C端缩短到第3个氨基酸（^749KGEPVSDQ^757）时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。     

番鸭细小病毒非结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定

为了分析番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus,MDPV)YL08株NS1蛋白(氨基酸序列全长627 aa)抗原表位,本研究设计了一套覆盖整个NS1蛋白的短肽,短肽长为30个氨基酸左右,有10个氨基酸重叠。为了表达这些短肽,共设计合成了31对互补的寡核苷酸片段。每对寡核苷酸片段5'端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后,插入至原核表达载体p ET-32a(+)中,经IPTG诱导获得了相应重组蛋白的表达。利用切胶纯化的方法对表达蛋白进行了纯化。应用MDPV YL08株人工感染番鸭血清对表达的31个重组蛋白的抗原性进行了检测,Western blot结果表明,表达的7个融合蛋白NS(481-510)、NS(501-530)、NS(521-550)、NS(541-570)、NS(561-590)、NS(581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所识别,而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所识别。同时,上述7个表达的融合蛋白不与灭活MDPV免疫番鸭血清反应。综合上述试验结果,MDPV YL08株NS1蛋白的B细胞线性抗原表位区位于NS1蛋白的羧基末端481 aa~627 aa。Dot-ELISA试验表明,重组蛋白NS(501-530)的抗原性相对更强。本研究为建立基于抗原表位的MDPV自然感染和人工免疫番鸭的鉴别诊断方法提供了理论依据。     

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定

为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。     

Mapping of two antigenic domains on the NS3 protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus

The immunodominant NS3 (p80) protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus (BVDV) functions as a serine protease and a RNA helicase. To identify antigenic domains of the BVDV NS3, a panel of monoclonal antibodies (mAbs) was tested against fragments of the protein expressed in E. coli. Two large overlapping NS3 fragments, A (amino acids [aa] 1-434) and B (aa 368-683) which together contain all NS3 sequences, were used to screen mAbs for reactivity. Two mAbs, 21.5.8 and 1.11.3, were reactive to fragment A (in ELISA only) and one mAb, 20.10.6, was reactive to fragment B (in ELISA and Western blotting). Further mapping demonstrated that the smallest fragment mAbs 21.5.8 and 1.11.3 bound to was comprised of aa 205-369 (domain A). In Western blotting, the smallest fragment reactive with mAb 20.10.6 was comprised of aa 368-549 (domain B). However, in indirect ELISA, mAb 20.10.6 also demonstrated high reactivity to a smaller fragment comprising aa 368-512 (domain B'). This indicated that the epitope of mAb 20.10.6 was conformational and not linear. Blocking ELISAs using these mAbs and type 1 and type 2 BVDV antisera demonstrated that an immunodominant region of the NS3 protein in cattle is defined by aa 205-549.     

基于兔出血症病毒衣壳蛋白优势抗原区的间接ELISA方法建立

为建立一种检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV）抗体的间接ELISA方法,首先扩增了VP60的优势抗原区A（31～250 aa）和B（470～579 aa）两个片段,然后应用融合PCR方法将A、B片段连接起来,克隆至pET-30a（＋）,转染BL21感受态细胞,进行原核表达。用Western blot方法对表达产物（AB）的免疫原性进行鉴定,再以纯化的AB为诊断抗原,通过对抗原-抗体反应条件的多重优化,建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法。试验结果表明,本研究成功表达了RHDV VP60的优势抗原区（AB）,重组蛋白的分子量约为36 kDa,该蛋白能与RHDV抗体发生特异性反应。以纯化的AB为包被抗原,成功建立了检测RHDV抗体的间接ELISA方法。经过对部分田间样品的检测和应用,证明该方法具有特异性强、重复性好、敏感性高等优点。本研究为将来开展RHDV的流行病学调查和疫苗研究等提供了良好的技术手段。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及鉴定

在分析水貂肠炎病毒VP2基因主要抗原位点分布的基础上,设计了1对特异性引物,克隆一段长为846 bp,编码主要抗原位点的基因片段。将该基因片段定向插入表达载体PET-32a中,转化BL21(DE3)菌株,IPTG诱导实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明,在37℃,IPTG浓度为1.0 mM,诱导时间为6 h,诱导表达达到最大效率。重组蛋白以包涵体形式存在,大小约为50 KD,应用兔抗水貂MEV抗体,经Western-blotting验证该重组蛋白具有MEV的抗原性,可为今后抗MEV单克隆抗体制备及相关免疫学检测方法的建立提供良好的抗原物质。     

Expression and antigenicity characterization for truncated capsid protein of porcine circovirus type 2

Three pairs of specific primers were designed to amplify F2-1, F2-2, and XF2-2 truncated capsid protein genes of porcine circovirus type 2 (PCV-2). Amplified sequences were subcloned to pET-32a(+) vectors and expressed in Rosetta (DE3) Escherichia coli by induction of isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG). All of the fusion proteins had positive reactions to PCV-2 antiserum and His-XF2-2 showed the best reactivity. Proteins were used to immunize BALB/c mice to produce monoclonal antibodies (mAbs), and 7 mAbs were selected. Capsid protein N-terminal parts 55 to 96 amino acid (aa), 97 to 141 aa, and 143 to 211 aa were confirmed as binding regions of the 7 mAbs. Reactivity between His-XF2-2 and the 7 mAbs was detected, FmAb-8 showed the best reactivity. The dominant B-cell epitope was located at 97 to 141 aa. The PEPSCAN indicated that the P122-136 peptide contained the dominant B-cell epitope.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表达载体的构建及免疫原性分析

为分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白5（GP5）的免疫原性,本研究通过提取PRRSV分离株（GenBank登录号：HQ701732.1）RNA和RT-PCR扩增得到开放阅读框5（ORF5）基因。根据ORF5的基因序列,设计2对引物,经PCR扩增分别获得不含信号肽和跨膜功能区的2段基因片段。利用酶切位点,将2段基因连接到原核表达载体pET-28a（+）上,获得重组表达质粒pET28a-GP5。将重组质粒导入BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得表达。经Western blotting鉴定,重组蛋白可被PRRSV阳性血清识别。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法检测,小鼠能产生针对蛋白的血清抗体。因此,该重组PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究GP5蛋白的结构和功能奠定基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。     

Partial purification and characterization of Gastrothylax crumenifer somatic antigens

The soluble extracts of Gastrothylax crumenifer isolated from the rumen of buffalo (Bubalus bubalis) were fractionated on a Sephadex G-200 column. A total of eight major fractions (F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, and F8) were separated from the whole homogenate of G. crumenifer, and each of these fractions was tested for their antigenicity by ELISA against rabbit hyperimmune sera. It was observed that F1, F2, F3 and F4 were highly antigenic, F6 and F7 were moderately antigenic and F5 and F8 were poorly antigenic. The individual fractions analysed after SDS-PAGE and Western blotting indicated that the antigenic fractions of G. crumenifer are of low molecular weight, in the range of <14-50kDa, and predominant antigenic components which were evident in most of the Sephadex profiles were of Mr 15, 18, 19, 23-24 and 28-32kDa.     

副猪嗜血杆菌广东分离株外膜蛋白P5基因的克隆及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从广东省HPS分离株外膜蛋白P5基因中扩增出与预期设计的1116bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,克隆出HPS广东分离株的目的基因,核苷酸长为1116bp,共编码371个氨基酸,与已发表的HPS(SH0165)外膜蛋白基因核苷酸序列同源性100%,氨基酸同源性100%。生物学预测分析结果显示,HPS外膜蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,其β-转角和无规则卷曲区域可能形成抗原表位;其N端含有1个信号肽,最佳切割位点在21～22个氨基酸;有15个抗原决定簇;无跨膜区;同源建模分析,未见相似三维结构。