抗凋亡蛋白cFLIP在山羊妊娠黄体中的表达

为研究山羊妊娠黄体中抗凋亡蛋白,即细胞FLICE样抑制蛋白(cellular FLICE-Like inhibitory protein,cFLIP)的表达,分析探讨cFLIP在维持山羊正常妊娠黄体中的作用。试验收集山羊不同妊娠阶段(19,31,92,142 d)的黄体组织,分别采用RT-PCR、Western blot及免疫组织化学分析等方法,以确定cFLIP免疫定位,检测cFLIP mRNA及其蛋白在山羊不同妊娠阶段黄体中的表达水平;分别以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA和β-肌动蛋白(β-actin)作为内在对照。结果显示,cFLIP短链(cFLIP_S)和cFLIP长链(cFLIP_L)的mRNA及cFLIP_S蛋白在妊娠期各阶段的表达水平无显著性差异(P0.05),而妊娠31d的cFLIP_L蛋白的表达水平却显著低于其他妊娠组(P0.05);免疫染色结果显示,cFLIP蛋白的阳性反应在山羊妊娠不同阶段的黄体中均有高度表达;在妊娠19,92,142 d的黄体中均有观察到PCNA阳性,在妊娠31 d发现PCNA阳性较微弱;并且在所有妊娠组黄体中,几乎观察不到细胞凋亡(TUNEL阳性)。因此,推测cFLIP作为一种生存因子,参与维持山羊正常妊娠,其在妊娠黄体组织中的高水平表达可能在维持山羊正常妊娠中发挥抗凋亡作用。     

茶黄素通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路促进小鼠乳腺肿瘤细胞凋亡

本试验旨在研究茶黄素促进小鼠乳腺肿瘤细胞凋亡的作用机制。采用不同浓度[0(A组)、48(B组)、88(C组)、128μmol/L(D组)]茶黄素处理小鼠乳腺肿瘤细胞(C-127细胞)24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡情况，荧光显微镜检测细胞活性与坏死情况，透射电镜观察细胞形态，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测半胱氨酸特异性天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达量，Western Blot法检测活化后的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、PI3K、Akt、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果显示：1)与A组相比，B组细胞存活率显著降低(P<0.05),C组、D组细胞存活率极显著降低(P<0.01)。2)与A组相比，B组、C组、D组细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。3)与A组相比，B组Akt的mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01),PI3K、Bcl-2的mRN...     

线粒体活性氧在氟化钠诱导PC12细胞NF-κB/NLRP3信号通路活化中的作用

旨在探究氟化钠(NaF)对PC12细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体的影响以及线粒体活性氧(mtROS)/核因子κB(NF-κB)信号在其中的调节作用。以PC12细胞为研究对象,分别转染NLRP3 siRNA、孵育NF-κB通路抑制剂PDTC(50μmol/L)或mtROS清除剂Mito-TEMPO(500μmol/L),并给予质量浓度为80 mg/L的NaF刺激24 h。通过CCK-8法检测细胞存活率,mitoSOX荧光探针检测mtROS水平,比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,ELISA法检测白细胞介素(IL)-18和IL-1β分泌,Western blot检测磷酸化NF-κB p65、磷酸化I-κB激酶β(iKKβ)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶1(Caspase-1) p20蛋白表达,免疫荧光测定NF-κB p65的入核。与NaF组比较,NLRP3 siRNA干预显著降低了NaF暴露引起的NLRP3和Caspase-1 p20蛋白表达水平升高(P<0.01),缓解了NaF诱导的细胞存活率降低(P<0.01)、...     

丁酸钠对脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞系炎性损伤的修复作用

本研究拟通过分析丁酸钠对脂多糖(LPS)诱导的奶牛乳腺上皮细胞系(MAC-T细胞)炎性损伤的修复作用,进一步从体外角度阐述丁酸钠对奶牛乳腺健康的调控机制。在MAC-T细胞中添加不同浓度(0、1、10、100、1 000、10 000 ng/mL)的LPS,检测细胞活力,以确定LPS的适宜浓度,建立细胞氧化损伤模型;并进一步在MAC-T细胞中添加不同浓度(0、2、4、8、16、32μmol/L)的丁酸钠,检测细胞凋亡率,以确定丁酸钠的适宜浓度。最终选用1 000 ng/mL LPS和16μmol/L丁酸钠用于本试验。试验分为3组,分别为对照组、LPS处理组和LPS+丁酸钠处理组,分别对其细胞形态、氧化应激指标及凋亡蛋白mRNA表达水平进行检测。结果表明:1)对照组MAC-T细胞呈扁平的无规则形态,贴壁状态良好;而LPS处理组MAC-T细胞核固缩、破裂,并出现大面积死亡脱落现象;LPS+丁酸钠处理组MAC-T细胞边缘清楚,胞内颗粒较少,死亡脱落现象明显减少。2)与对照组相比,LPS处理组MAC-T细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化力(T-AOC)显著降低(P<0.05),丙二醛(MDA)含量显著升高(P<0.05);与LPS处理组相比,LPS+丁酸钠处理组MAC-T细胞中SOD活性和T-AOC含量显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,LPS处理组MAC-T细胞中半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax) mRNA表达水平显著或极显著升高(P <0.05或P <0.01),B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)mRNA表达水平极显著降低(P<0.01);与LPS处理组相比,LPS+丁酸钠处理组MAC-T细胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平显著下降(P<0.05),Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。由此可见,丁酸钠对LPS造成的MAC-T细胞氧化损伤起到了一定的修复作用,减少了细胞凋亡的发生。     

线粒体凋亡途径在玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞凋亡中的作用

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEA)雄性生殖毒性作用机理,研究ZEA诱导大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)的凋亡途径,试验选取大鼠原代SC为研究材料,用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理SC 24 h后,采用实时荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2 mRNA表达水平;用Western blotting法检测Bax、Bcl-2等线粒体凋亡途径相关蛋白表达;同时检测了20μmol/L ZEA联合Caspase-8抑制剂(Z-IETD-FMK)处理对SC凋亡率和线粒体凋亡相关蛋白的影响。结果显示,与对照组相比,20μmol/L ZEA组细胞Bcl-2转录水平显著下降(P<0.05),Bax转录水平显著上升(P<0.05);10、20μmol/L ZEA组Bax/Bcl-2比值及Cyto-CytC、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3表达量极显著上升(P<0.01),而Mito-CytC表达量极显著下降(P<0.01);与ZEA组相比,ZEA与Z-IETD-FMK联合处理可使ZEA诱导的SC凋亡率极显著下降(P<0.01),tBid/Bid、Bax/Bcl-2、Cyto-CytC、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9蛋白表达显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而Mito-CytC表达量极显著上升(P<0.01)。综合试验结果,ZEA能够通过线粒体途径诱导大鼠SC发生凋亡。     

玉米赤霉烯酮对不同时期小鼠子宫细胞凋亡及凋亡因子的影响

本试验旨在研究在饲粮中添加不同水平的玉米赤霉烯酮(ZEA)对发情前期、发情期、产仔后雌性小鼠子宫细胞凋亡及相关因子的影响。选取4周龄昆明雌性小鼠120只,随机分为4组,每组30只。选取雄性小鼠20只,随机分为4组,每组5只。7 d预试期结束后,试验分2个阶段。第1阶段,各组雌鼠分别饲喂在基础饲粮中添加0(对照)、50、100、150 mg/kg ZEA的饲粮,饲喂时间是20 d。饲养试验结束后的第2、3、4天,通过阴道涂片法每组挑选出发情前期、发情期小鼠各10只,脱椎处死,摘取子宫角,用于子宫细胞凋亡原位末端标记法(TUNEL)染色和凋亡相关因子mRNA表达量的检测。第2阶段,每组剩余雌鼠与雄鼠按2∶1进行合笼,至产仔后,按上述方法采样检测。结果表明:1)发情前期凋亡细胞主要位于子宫内膜间质细胞及上皮细胞;与对照组相比,添加100、150 mg/kg ZEA极显著提高凋亡阳性表达细胞平均光密度值(P<0.01),且极显著上调半胱天冬蛋白酶(caspase)-3、caspase-8、caspase-9及B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2) mRNA相对表达量(P<0.01); 2)发情期细胞凋亡主要集中在子宫内膜间质细胞、子宫内膜上皮细胞及子宫腺上皮细胞;与对照组相比,随着ZEA添加水平的增加,凋亡细胞呈剂量依赖性增加(P<0.01),能够极显著上调凋亡相关基因mRNA相对表达量(P<0.01); 3)产仔后期凋亡细胞分布较为均匀;与对照组相比,添加150 mg/kg ZEA凋亡程度极显著增加(P<0.01);添加100 mg/kg ZEA能够显著上调Bcl-2、caspase-3 mRNA相对表达量(P<0.05),添加150 mg/kg ZEA能够显著上调caspase-8、caspase-9 mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,ZEA能够促进不同时期小鼠子宫细胞凋亡,并且能够上调凋亡相关基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bcl-2表达。     

热休克蛋白70上调表达对热应激猪小肠上皮细胞凋亡的影响

本试验以谷氨酰胺作为热休克蛋白70(HSP70)诱导剂,从细胞凋亡线粒体信号转导途径探讨HSP70对热应激猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)凋亡相关因子的影响。试验以体外培养的猪小肠上皮细胞为模型,分别加入不同浓度(1、2、4、6、8、10 mmol/L)谷氨酰胺的培养基中培养24 h,提取总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot检测HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量,筛选出谷氨酰胺诱导HSP70表达的最佳浓度。取对数生长期的细胞分为3组,分别为对照组(Con组,37℃培养12 h)、热应激组(Hs组,42℃培养12 h)、谷氨酰胺组(Gln组,6 mmol/L谷氨酰胺、42℃培养12 h)。采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP70、凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的mRNA和蛋白的相对表达量。结果表明:谷氨酰胺对HSP70上调表达呈先上升后下降的趋势,6 mmol/L的谷氨酰胺诱导时HSP70 mRNA和蛋白相对表达量最高,显著高于其他浓度(P<0.05),作为后续试验中Gln组的诱导条件。与Con组相比,Hs组细胞凋亡率极显著增加(P<0.01),HSP70、Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01),而Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01)。与Hs组相比,Gln组细胞凋亡率极显著降低(P<0.01),但仍极显著高于Con组(P<0.01);Gln组HSP70 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01);Gln组Apaf-1、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的相对表达量极显著降低(P<0.01),但极显著高于Con组(P<0.01);Gln组Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量极显著升高(P<0.01),但极显著低于Con组(P<0.01)。由此可见,上调HSP70的表达可有效缓解热应激导致的猪小肠上皮细胞凋亡。     

SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的影响

睾丸未成熟支持细胞的增殖活性对种公畜繁殖性能有重要影响，睾丸基因组DNA甲基化(5mC)不同发育阶段特异性引起的基因差异表达可以调控支持细胞的增殖活性。在课题组前期研究中，SMAD6被鉴定出是睾丸发育过程中受3′UTR甲基化水平调控的枢纽基因之一，但其生物学功能尚未被发掘。本研究旨在探究SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用。在体外培养的猪未成熟支持细胞中过表达SMAD6或干扰SMAD6表达后，检测细胞周期和增殖相关基因的相对表达量、细胞增殖情况、细胞ATP水平、细胞凋亡率及凋亡相关蛋白的表达情况。结果显示：过表达SMAD6后细胞周期及增殖相关基因的相对表达量上升(P<0.05或P<0.01)、细胞增殖增加(P<0.05或P<0.01)、细胞ATP水平升高(P<0.01)、细胞的凋亡率下降(P<0.05)、促凋亡相关蛋白BAX和Caspase3的表达降低(P<0.05);干扰SMAD6表达结果则与之相反。研究结果提示，SMAD6促进猪未成熟支持细胞的增殖且抑制其凋亡。     

TLR 4在绵羊肺炎支原体介导肺泡上皮细胞凋亡中的作用机理

为了分析TLR4在绵羊肺炎支原体介导肺泡上皮细胞凋亡中的分子机制,以绵羊肺泡上皮细胞为材料,用不同浓度的抑制剂TAK-242与细胞孵育,用MTT法检测细胞活性,用试剂盒检测Caspase-3和Caspase-8的活性,以及用实时定量PCR检测TLR4和TNF-αmRNA的表达水平,接着用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:当抑制剂TAK-242浓度为1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L不影响细胞活性,而当浓度为20 nmol/L和30 nmol/L时细胞活性显著降低(P<0.05);在感染比例(MOI)为10的情况下,在12 h和24 h支原体可以提高TLR4 mRNA的表达水平;绵羊肺炎支原体可显著提高Caspase-3和Caspase-8的活性,而TAK-242能够显著降低Caspase-3和Caspase-8的活性(P<0.01);在感染时间为24 h,支原体可以提高促TNF-αmRNA的表达水平,而抑制剂TAK-242在10 nmol/L的浓度下可以降低支原体介导的TNF-αmRNA的表达水平;在24 h支原体引起的细胞的细胞凋亡率为16.7%±1.81%,而抑制剂TAK-242处理组引起的细胞凋亡率为11.7%±1.32%。表明TLR4在绵羊肺炎支原体诱导肺泡上皮细胞凋亡中发挥重要作用。     

线粒体凋亡途径在锰致鸡支持-生精细胞凋亡中的作用

探讨线粒体凋亡途径在锰致鸡支持-生精细胞凋亡中的作用。取对数生长期鸡支持-生精细胞,用含0、2、3、4mmol.L-1MnCl2的DMEM培养液,培养24h,采用吖啶橙-溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法检测鸡支持-生精细胞凋亡,流式细胞仪检测线粒体膜电位(△ψm),Westernblot法检测胞浆内细胞色素C(Cytc)蛋白表达含量,分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9,3(Caspase-9,3)活性。用含MnCl2的DMEM培养液培养24h后,处理组细胞与对照组相比,鸡支持-生精细胞凋亡指数逐渐升高(P0.01);线粒体膜电位显著降低(P0.01);胞浆中Cytc蛋白表达量逐渐增加;Caspase-9,3活性逐渐升高(P0.01)。线粒体途径介导的凋亡是锰对鸡生殖毒性作用的主要机制之一。     

几种中药单体促进阿霉素内化协同诱导白血病细胞凋亡

为了分析3种中药单体对白血病细胞内化阿霉素和诱导细胞凋亡的影响,采用体外培养白血病细胞,以10μmol/L阿霉素处理,或同时加入中药单体(去甲基斑蝥素,β-榄香烯和姜黄素)处理细胞。流式细胞术分析处理1,2 h和4 h后细胞内化阿霉素的相对含量。继续培养至16 h,流式细胞术分析细胞凋亡,并用免疫印迹技术分析细胞内活化Caspase-3的表达。结果3种中药单体中,去甲基斑蝥素和姜黄素具有显著促进阿霉素内化和促进细胞凋亡的效应;β-榄香烯也可增强阿霉素诱导细胞凋亡的效应,但对阿霉素内化无显著影响;去甲基斑蝥素和姜黄素与阿霉素联合可增加活化Caspase-3水平。表明3种中药单体均可增强阿霉素诱导白血病细胞凋亡的效应,其中去甲基斑蝥素和姜黄素的增敏效应与其促进阿霉素的内化相关。     

细胞凋亡抑制蛋白cFLIP在小鼠妊娠黄体中的表达

为了观察FLICE样抑制蛋白(cFLIP)在小鼠卵巢妊娠黄体中的表达情况,试验选择10周龄以上的ICR系健康小鼠,采用苏木精-伊红(H.E.)染色、cFLIP染色、PCNA染色、TUNEL染色方法分别对妊娠12.5天、16.5天、18.5天的黄体进行观察分析。结果表明:cFLIP在小鼠妊娠12.5天、16.5天、18.5天的黄体中均有高度表达。说明cFLIP可能作为抗凋亡因子参与小鼠妊娠黄体的维持。     

布鲁氏菌侵染过程中has-miR-5196-3p对炎症小体的调控作用

试验旨在研究miRNA分子has-miR-5196-3p在布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中对NOD样受体蛋白3炎症小体（NLRP3）的调控作用。运用TargetScan、MiRDB等生物信息学预测网站预测has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的结合位点,构建其野生型及突变型双荧光素酶报告载体,分别与has-miR-5196-3p mimics及阴性对照共转染293T细胞,通过双荧光素酶报告系统检测各组相对荧光素酶活性的变化,验证has-miR-5196-3p和NLRP3-3'UTR的靶向关系;布鲁氏菌侵染THP1细胞,实时荧光定量PCR检测NLRP3、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase1）及has-miR-5196-3p mRNA的表达情况,Western blotting检测NLRP3和caspase1蛋白表达水平;将has-miR-5196-3p mimics、has-miR-5196-3p inhibitor及阴性对照转染至THP1细胞,实时荧光定量PCR及Western blotting检测NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase1）的表达水平。结果显示,试验成功构建含有NLRP3-3'UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告载体;has-miR-5196-3p mimics极显著降低pmirGLO-NLRP3-3'UTR-wt的相对荧光素酶活性（P<0.01）;布鲁氏菌侵染THP1细胞后,NLRP3炎症小体被激活,而has-miR-5196-3p无明显变化（P>0.05）;has-miR-5196-3p mimics能显著抑制NLRP3的表达（P<0.05）,而has-miR-5196-3p inhibitor则相反。结果表明,miRNA分子has-miR-5196-3p可与NLRP3-3'UTR结合并抑制其表达,布鲁氏菌侵染THP1细胞过程中通过has-miR-5196-3p靶向负调节NLRP3炎症小体的表达及炎症的发生。     

桑椹矢车菊素-3-芸香糖苷抵抗链脲佐菌素诱导胰岛β细胞凋亡的作用

矢车菊素-3-芸香糖苷(C3R)是桑椹花青素的主要成分,研究从成熟桑椹中提取C3R对链脲佐菌素(STZ)诱导人源性胰岛β细胞凋亡的抑制作用及可能的调控机制。采用MTT法及流式细胞计数检测发现:桑椹C3R对正常胰岛β细胞株INS-1具有极显著的促增殖作用(P0.01);50μg/m L桑椹C3R液处理STZ诱导凋亡模型胰岛β细胞株INS-1 48 h后,其早期凋亡、晚期凋亡和坏死的细胞数量极显著下降(P0.01)。以经桑椹C3R液处理的STZ诱导凋亡模型胰岛β细胞的c DNA为模板,通过qRT-PCR检测细胞中的几个凋亡相关蛋白基因的转录水平变化,其中抗凋亡蛋白基因Bcl-x L的mRNA转录水平极显著上调(P0.01),促凋亡蛋白基因Bad、Bax及Caspase 8、Caspase 6基因的mRNA转录水平极显著下调(P0.01)。研究结果表明,桑椹C3R对STZ诱导的胰岛β细胞凋亡具有明显的抵抗作用,由此也证实了桑椹花青素的药用开发价值。     

虾青素对氧化应激小鼠肝原代细胞的保护作用

试验旨在研究虾青素对过氧化氢(H_2O_2)诱导小鼠肝原代细胞产生氧化应激的影响。采用改进的原位二步灌流法提取ICR小鼠肝原代细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率、活细胞率的变化,生物化学法测定细胞中丙二醛(MDA)含量、过氧化氢酶(CAT)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的活性变化;荧光定量PCR测定CAT、γ-GCS催化亚基(GCLC)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA相对表达量的变化,ELISA法检测细胞中Keap1、Nrf2蛋白的变化。结果表明:虾青素能够降低H_2O_2诱导小鼠肝原代细胞产生氧化应激的细胞凋亡率、MDA含量、Nrf2和Keap1 mRNA相对表达量(P<0.05),提升活细胞率、CAT和γ-GCS活性(P<0.05)、CAT和GCLC的mRNA相对表达量(P<0.05),抑制Nrf2蛋白及Keap1蛋白的表达(P<0.05)。虾青素能够促进相关抗氧化酶的活性,抑制Nrf2蛋白及Keap1蛋白表达进而抑制Keap1-Nrf2-ARE信号通路的激活。     

神经肽S及其受体对伪狂犬病病毒感染的体外作用研究

为了解神经肽S（NPS）及其受体（NPSR）在伪狂犬病病毒（PRV）感染过程中的作用,本试验采用细胞培养、RT-PCR、实时荧光定量PCR及shRNA技术研究NPS和NPSR在PRV体外感染过程中的表达变化,以及NPS和NPSR对病毒基因和相关细胞因子的变化。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示,PRV感染培养的小鼠胚胎成纤维细胞系（3T3细胞）后12和18 h,NPS和NPSR mRNA的表达水平极显著上升（P<0.01）;通过shRNA技术稳定干扰3T3细胞中NPSR表达后,PRV gE基因的表达极显著下调（P<0.01）;添加外源性NPS可显著增强PRV感染的3T3细胞PRV gE基因及细胞因子白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达水平（P<0.05）;添加NPSR抑制剂后,则极显著抑制细胞中PRV gE基因和细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平（P<0.01）,该作用效果与NPS的作用效果相反。上述结果表明,降低NPSR的表达能有效抑制PRV在3T3细胞上的复制,说明NPSR是PRV有效感染3T3细胞所必需的重要因子;外源性NPS可通过调节炎症细胞因子的表达而加剧PRV感染诱导的炎症反应。本研究结果为深入探索NPS和NPSR在PRV感染动物体内的调节作用奠定了基础。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路调控猪肠上皮细胞精氨酸转运的机制

本研究旨在基于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探讨猪肠上皮细胞增殖和精氨酸(Arg)转运的调控机制。在含100或350μmol/L Arg的培养基中添加(10 nmol/L)或不添加(0 nmol/L)雷帕霉素(Rap),培养猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)3 d后,对细胞活力、细胞周期以及Arg转运、增殖和凋亡相关通路基因和蛋白表达进行检测。结果表明:1)添加Rap极显著降低了G2期和S期细胞数量(P0.01),而提高Arg浓度有效缓解了Rap对细胞增殖的抑制作用;Rap通过激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)-蛋白激酶(Akt)-B细胞淋巴瘤2(Bcl2)信号通路抑制细胞凋亡。2)添加Rap抑制mTOR信号通路后极显著提高了Arg摄取率(P0.01),极显著提高了100μmol/L Arg培养下细胞中阳离子氨基酸转运载体2(CAT2)的mRNA和蛋白表达量(P0.01);进一步试验证明蛋白激酶Cα(PKCα)-细胞外信号调节激酶(Erk)/cFos-CAT2信号通路可能是Rap促进CAT2表达,进而提高Arg摄取的重要通路。综上可知,Rap应激下猪肠上皮细胞增殖被抑制,提高Arg浓度能有效缓解Rap对细胞增殖的抑制作用;Rap通过调控PKCα-Erk/cFos-CAT2信号通路促进猪肠上皮细胞对Arg的摄取,且提高Arg浓度可促进细胞对Arg的摄取。结果提示,mTOR信号通路在调控猪肠上皮细胞Arg利用过程中发挥重要作用。     

亮氨酸对猪胎盘滋养层细胞增殖及氨基酸转运的影响

为研究亮氨酸(Leu)对猪胎盘滋养层细胞(pTr)增殖、凋亡以及氨基酸转运载体表达的影响及其机制,本试验用不同浓度Leu(0、1、10 mmol/L)分别处理pTr细胞24 h和48 h后,使用荧光定量PCR技术检测pTr细胞增殖和凋亡相关基因、氨基酸转运载体以及mTOR信号通路关键蛋白等的mRNA表达水平。结果表明:Leu处理pTr细胞24 h后,1 mmol/L试验组的SNAT1(P<0.01)、4E-BP1 (P<0.05)和eIF4G(P<0.05)的mRNA相对表达量低于对照组;Leu处理pTr细胞48 h后,1 mmol/L试验组LAT1(P<0.05)、4E-BP1(P<0.01)的mRNA相对表达量低于对照组,10 mmol/L试验组CDK4(P<0.05)、4E-BP1 (P <0.01)、SNAT1 (P <0.01)、SNAT2 (P <0.01)、LAT1 (P <0.01)以及rBAT (P <0.05)的mRNA相对表达量也低于对照组;Leu处理pTr细胞24 h和48 h后,10 mmol/L组mTORC1的mRNA相对表达量较对照组和1 mmol/L组均极显著提高(P<0.01)。可见,10 mmol/L Leu会抑制pTr细胞的增殖活力,并可能通过mTOR信号通路的介导,降低了pTr细胞氨基酸转运载体的表达。     

不同氮源对山羊回肠黏膜上皮细胞凋亡的影响

试验旨在研究以蛋氨酸(Met)、NH₄Cl为不同氮源对山羊回肠黏膜上皮细胞凋亡的影响。试验采用细胞增殖试验、Hochest33342染色荧光显微镜检测、流式细胞术检测、线粒体膜电位的检测、检测凋亡关键蛋白的表达、观察通路关键蛋白表达等方法进行研究。结果显示,以无机氮源NH₄Cl代替有机氮源Met诱导回肠上皮细胞发生细胞体积缩小、细胞核固缩及由此引起的荧光染色颗粒增亮等形态学变化,发生线粒体膜电位和凋亡关键蛋白的表达显著下调(P<0.05),细胞发生凋亡。凋亡的发生促使促凋亡蛋白半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、P53抑癌基因(p53)和BCL2-Associated X的蛋白质(Bax)的表达显著上调(P<0.05),而抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤因子2 xl(Bcl-xl)显著下调(P<0.05)。研究表明,Met缺失组和0.20 mmol/L NH₄Cl组均通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通...     

胸腺上皮细胞中雌激素诱导lncRNA的鉴定分析及表达载体构建

为研究胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells,TECs)中雌激素(estradiol,E2)对长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表达的调节作用,本研究首先培养小鼠胸腺髓质上皮细胞系1(medullary thymic epithelial cell line 1,MTEC1),经50 nmol/L E2作用24 h后,观察对细胞表型变化的影响,并用CCK-8试剂盒检测细胞活力;提取细胞总RNA,运用实时荧光定量PCR技术验证E2对lncRNA-2410006H16Rik表达的调节作用;最后运用RT-PCR技术扩增其目的基因,构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik重组过表达载体。结果显示,50 nmol/L E2能够明显抑制MTEC1的增殖,且相较于对照组细胞,50 nmol/L E2处理组细胞的D450 nm值极显著降低(P<0.01),表明其细胞活力极显著下降。实时荧光定量PCR结果显示,在E2作用下,lncRNA-2410006H16Rik在MTEC1细胞中的表达极显著上调(P<0.01),约是对照组的2倍,与高通量测序结果一致。经RT-PCR、双酶切及测序结果分析显示,试验成功构建pEGFP-N1-lncRNA-2410006H16Rik表达载体。结果表明,TECs中lncRNA-2410006H16Rik的表达与E2作用密切相关,为后续在细胞水平上进一步验证lncRNA-2410006H16Rik的调节功能奠定了基础。