和田羊FGF5基因的鉴定及特征分析

为探究和田羊成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5,FGF5)基因特征,利用RT-PCR成功扩增和田羊FGF5基因,对其核苷酸序列及其编码的氨基酸特征进行同源分析,并绘制进化树。结果表明,和田羊FGF5基因CDs区全序列长度为813 bp,为一个完整的开放阅读框,编码270个氨基酸,测序结果经比对后与已发布的绵羊FGF5基因CDs区序列同源性为99.8%,氨基酸序列同源性为99.3%,编码的氨基酸有2处突变,氨基酸序列中20种氨基酸数量分布差异较大。与其他已公布的哺乳动物FGF5基因CDs区同源比对结果显示,该基因同源性在86.9%～99.0%之间,其中与山羊的同源性最高,为99.0%。对上述动物FGF5氨基酸序列绘制进化树发现,和田羊FGF5基因所编码氨基酸与牛、山羊和绵羊处在同一分支,表明其亲缘关系接近。通过对和田羊FGF5基因和编码氨基酸的特征和同源性进行分析,为深入探究和田羊FGF5基因编码蛋白提供了理论依据。     

牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析

利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。     

新疆北疆某规模化牛场奶牛副结核病的检测与分析

为查明导致新疆北疆某规模化牛场奶牛腹泻、消瘦的主要病原菌,本研究采用微生物学与分子生物学方法对采集的患牛粪便进行检测与鉴定。结果显示:2份粪样抗酸染色阳性,IS900基因及亚型分型基因检测阳性,IS900基因与GenBank中多个副结核分枝杆菌序列同源性在99%以上,亚型分型基因与Ⅱ型同源性为99.81%,从而确定2份样本均被Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌感染。     

牛分枝杆菌遗传学研究进展

一、牛分枝杆菌基因组 牛分枝杆菌AF2212/97分离自肺部和支气管纵隔淋巴结发生干酪样病变的母牛,具有完全的毒力.该菌株基因组全长为4345492bp,分布于一单环染色体中,平均G C含量为65.63%.基因组包含3952个编码蛋白基因--包括一个前噬菌体和42个插入单位(IS).在核苷酸水平上,牛分枝杆菌与结核分枝杆菌基因组相比,其同源性大干99.95%,表现出共线性,没有广泛的置换、复制或倒置现象.     

牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析

扩增大庆地区分离的牛副流感病毒3型的N基因,并进行同源性分析。设计特异性引物,通过聚合酶链反应扩增牛副流感3型N基因,将该基因分别连接到克隆载体的BamHⅠ、HindⅢ酶切位点中,测定插入片段的核苷酸序列,并利用分子生物学软件进行同源性分析。序列分析结果表明,扩增获得BPIV-3-N基因全长1 548bp,编码515个氨基酸,该N段基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GenBank中日本分离株910N基因序列同源性较高,核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为100%。     

贵州黑山羊RERG基因cDNA克隆与序列分析

选择与羊同源性较高的牛RERG基因组序列设计特异性引物,提取贵州黑山羊脾脏总RNA,通过RT-PCR技术对RERG基因进行克隆测序及序列分析。结果:首次克隆了贵州黑山羊RERG基因cDNA序列629 bp,GenBank登录号为JN672576,编码199个氨基酸;贵州黑山羊RERG基因蛋白与牛的同源性高达98.5%;聚类分析表明RERG基因编码区适于构建种间系统进化树。     

水牛κ-酪蛋白外显子4基因的克隆及序列分析

本研究根据普通牛的κ-酪蛋白基因设计一对引物,首次成功扩增出了水牛的κ-酪蛋白外显子4基因,并经序列分析,结果表明κ-酪蛋白外显子4基因片段长780 bp。利用GenBank上的Blast进行比较,中国水牛κ-酪蛋白外显子4序列与地中海水牛、牛、牦牛的κ-酪蛋白外显子4序列同源性分别为99.5%、96.4%、95.9%;氨基酸同源性比较,中国水牛、地中海水牛、牛、牦牛均编码260个氨基酸,中国水牛与地中海水牛、牛、牦牛同源性分别为98.9%、92.0%和91.2%。核苷酸和氨基酸序列同源性结果显示,中国水牛和地中海水牛κ-酪蛋白基因变异不大。但由于在碱基230 bp处发生了一个碱基(A→C)的变化,从而导致其氨基酸也发生了变化,即K(Lys赖氨酸)→R(Arg精氨酸)。本研究为进一步对该基因的功能奠定基础。     

口蹄疫病毒受体牛源β1亚基基因的分子特征

从口蹄疫病毒试验感染康复牛肺组织中克隆了β1亚基基因,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行了比较分析.结果显示,牛β1亚基基因的编码区含有2 397个核苷酸,编码798个氨基酸,含有10个潜在的糖基化位点,其中信号肽由20个氨基酸组成,胞外域由708个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞浆域由41个氨基酸组成.与GenBank中的牛β1基因的同源性达99.5%,从起始密码子开始共有12个碱基发生了变化,引起第217、247、268、281、321、691、709位的氨基酸改变,分别由F、S、W、V、H、Y、V变为S、P、R、G、Y、C、G.牛β1基因与猪、猩猩、猫、犬、人、小鼠和鸡的β1基因核苷酸序列同源性分别为93.8%、89.3%、91.6%、90.2%、89.6%、85.4%、75.6%,推导氨基酸序列同源性分别为98.2%、93.7%、97.5%、96.7%、94.2%、93.2%、84.1%.牛与猪β1亚基同源性最高.     

牛源乙肝病毒套式PCR检测方法的建立及其S靶基因同源性分析

为建立牛源乙肝病毒(HBV)套式PCR检测方法,本研究根据GenBank中人HBVS基因,设计2对引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立检测牛源HBV的套式PCR检测方法,并进行S基因片段序列同源性和系统发育进化树分析。结果表明:该方法第1次PCR扩增的敏感性是1.00pg,第2次PCR敏感性是0.32fg,扩增产物分别为509bp、240bp,而牛病毒性腹泻病毒、丝状支原体丝状亚种SC型、牛结核分枝杆菌的扩增结果均为阴性。牛源HBVS基因片段序列与GenBank中人HBVS基因进行比对,核苷酸同源性98.8%～99.4%,氨基酸序列同源性97.1%～98.3%。研究表明建立的牛源HBV套式PCR具有很好的特异性和敏感性,可用于牛源HBV的检测,并对进一步研究牛源HBV与人HBV之间的关系奠定了基础。     

分枝杆菌噬菌体CJAUS5株holin基因的克隆与序列分析

为了研究噬菌体裂解宿主菌的机制,开发噬菌体裂解相关蛋白的应用价值,试验参照Gen Bank中登录的holin基因序列设计特异性引物,以分枝杆菌噬菌体CJAUS5基因组为模板,经PCR扩增出411 bp的条带。构建重组质粒p MD19-T-holin,经双酶切鉴定呈阳性后进行测序分析。结果显示,克隆出的holin基因与已知分枝杆菌肌尾噬菌体holin序列同源性高达99.03%~99.51%;编码的氨基酸同源性高达99%~100%。对holin基因编码的蛋白进行分析表明,Holin蛋白具有亲水性C端和两个跨膜区域。研究成功克隆了分枝杆菌噬菌体CJAUS5的holin基因并进行了氨基酸序列分析,为进一步研究Holin蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

An RTX operon in hemolytic Moraxella bovis is absent from nonhemolytic strains

Pathogenic isolates of Moraxella bovis express a calcium-dependent transmembrane pore forming cytotoxin that is an RTX toxin encoded by mbxA. The DNA flanking mbxA was cloned and sequenced to determine if M. bovis contained a classical RTX operon. Open reading frames (ORFs) with deduced amino acid sequence homology to putative activation (RTX C) and transport (RTX B and D) proteins were identified and have been designated MbxC, MbxB, and MbxD, respectively. Thus, hemolytic M. bovis contains a typical RTX operon comprised of four genes arranged (5'-3') mbxCABD. In addition, the deduced amino acid sequences of DNA flanking mbxCABD revealed ORFs with amino acid sequence similarity to transposases (5'). At the 3' end of the mbx gene cluster, an ORF with homology to bacterial tolC genes was identified. Thus, as with the cya RTX operon of Bordetella pertussis, M. bovis appears to have a secretion accessory protein linked to RTX genes. Analysis of genomic DNA isolated from 5 nonhemolytic M. bovis strains by PCR and Southern blotting revealed the absence of mbxCABD. These strains did, however, amplify with primers specific for the 5' region flanking mbxC. M. bovis harbors a classical RTX operon that is absent in nonhemolytic strains.     

狂犬病鼠源野毒M株核蛋白基因的克隆及序列分析

从感染狂犬病的鼠脑中快速提取细胞总RNA，用RT—PCR方法得到编码核蛋白完整结构基因的cDNA，进一步将此基因克隆入pGEM—T中，进行核苷酸序列的测定，并推导出氨基酸序列，将这一序列与国内外已发表的9株狂犬病病毒的NP全基因进行比较分析。结果表明狂犬病鼠源野毒M株与上述9株的同源性在71．0％～99、8％之间，氨基酸同源性在77．6％～99．6％之间，M株与CVS株无论核苷酸序列还是氨基酸序列同源性都最高，分别为99．8％和99．6％，而与CTN珠的核苷酸序列同源性较低，与Mokola株的核苷酸序列以及氨基酸序列同源性都最低，分别为71．0％和77．6％。本研究为进行狂犬病病毒的分子流行病学调查和研制狂犬病基因工程苗提供了理论依据。     

山羊c-Myc基因的克隆及序列分析

为了克隆出山羊c-Myc基因的CDS区序列,本研究利用RT-PCR技术,参照GenBank报道的绵羊、牛、猪、马等的c-Myc基因CDS区序列设计出特异性引物,从山羊胚胎皮肤组织中扩增出山羊c-Myc CDS区序列并进行序列分析。结果表明,山羊c-Myc基因CDS区全长1320 bp （包括终止密码子）,与绵羊c-Myc基因核苷酸序列（GenBank登录号：Z68501.1）比对仅有10处存在差异,其核苷酸序列同源性为99.17%,推导的氨基酸序列同源性为99.09%;与其他物种进行同源性分析结果显示,山羊c-Myc基因CDS区与猪、狼、人、大鼠、小鼠的核苷酸序列同源性分别为91.2%、92.0%、90.2%、86.9%、86.0%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、96.1%、92.3%、91.1%、89.6%;生物信息学软件分析结果表明,山羊c-Myc蛋白产物定位于细胞核并含有HLH结构域。本研究为进一步了解c-Myc基因的功能及探讨其在山羊体细胞重编程过程中的作用奠定了基础。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株pol基因的克隆与序列分析

参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株pol基因序列设计了2对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的pol基因片段,将其克隆到PMD19-T载体后测序。应用计算机软件将测定序列与内源性南非代表毒株enJS56A1(AF153615)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.3%,推导出的氨基酸同源性为95.0%。与外源性南非代表株JSRV-SA(M80216)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.0%,氨基酸同源性为99.3%。这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒pol基因序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。     

犬贾第虫病毒(长春株)全基因组序列分析

根据已报道的人源蓝氏贾第虫病毒序列设计了互相重叠的6对特异性引物，以犬贾第虫（长春株）纯培养滋养体总核酸为模板进行RT—PCR。PCR产物连接到pMD18-T载体进行测序，通过BLAST在GenBank进行同源性搜索，并用DNAMAN分子生物学软件进行分析。结果测得我国犬贾第虫病毒（长春株）基因组全长为6276bp（DQ238861），编码1个有887个氨基酸残基的衣壳蛋白和1056个氨基酸残基的融合蛋白，这2个阅读框被-1核糖体移码框分开，重叠处有220nt。基因组中G＋C占49．62％。其序列与国外报道的人源蓝氏贾第虫病毒（L13218）序列同源性为94．62％，编码的氨基酸同源性为93．50％；与国内人源蓝氏贾第虫病毒（AF525216）序列同源性为98．88％，编码的氨基酸同源性为98．30％。     

牛支原体pdhc基因的克隆、表达及其亚细胞定位

试验旨在研究牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶（PDHc-E2）基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因（登录号：CP002058.1）设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a（+）中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体（M.agalactiae）同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体（M.californicum）ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。     

水貂 β-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。     

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株gag基因3''''端951 bp段的分子克隆与序列分析

究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951 bp的特异条带,将其回收后克隆人pMD-18T载体中,并进行序列测定.结果表明,与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为95.4%,推导出的氨基酸同源性为95%.与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为91.3%,氨基酸同源性为91%.这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础.