内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株（NM）总DNA，参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段，将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列，并用DNAStar软件进行序列分析，分析结果表明，与内源性南非代表毒株enJS56A1（AF153615）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为98．9％，推导出的氨基酸同源性为98．4％。与外源性美国代表株JSRV21（AF105220）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．6％，氨基酸同源性为94．8％。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测，结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子，这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列，为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株gag基因3''''端951 bp段的分子克隆与序列分析

究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951 bp的特异条带,将其回收后克隆人pMD-18T载体中,并进行序列测定.结果表明,与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为95.4%,推导出的氨基酸同源性为95%.与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为91.3%,氨基酸同源性为91%.这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础.     

内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99．4％,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971．1的核苷酸同源性为90．4％。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列，设计合成3对引物，对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，分别呈3条531、888和949 bp的特异条带，将其分别克隆人pMD-18T载体中，进行序列测定并拼接序列，得到完整的gag基因序列。分析结果表明，与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．0%，推导出的氨基酸同源性为90％。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较，核苷酸同源性为86．3％，氨基酸同源性为87％。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。     

1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒的序列测定与分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。     

1株B亚型禽偏肺病毒的分离与鉴定

从山东省多个地区的商品肉鸡养殖场采集64份疑似病料,通过RT-PCR方法检测出37份禽偏肺病毒阳性病料,以此作为病毒分离材料接种SPF鸡胚,盲传至第7代时鸡胚生长明显迟滞。取阳性尿囊液在CEF中培养,呈现禽偏肺病毒典型细胞病变(CPE):细胞变圆、悬浮,有合胞体形成。将分离株接种于Vero细胞及DF-1细胞均出现类似病变。对分离株F基因进行测序,并与GenBank中发表的部分代表序列比较。结果显示,与B亚型禽偏肺病毒的核苷酸同源性最高,为97.4%⁹9.3%;与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低,为77.4%99.3%;与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低,为77.4%⁷8.1%;而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低,为69.5%78.1%;而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低,为69.5%⁶9.7%。基因分型显示分离株为B亚型禽偏肺病毒,将该毒株命名为禽偏肺病毒SDWF株。     

猪传染性胃肠炎病毒吉林株的分离鉴定及S基因的克隆与序列分析

利用PK-15细胞从临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠系膜淋巴结材料中分离获得1株病毒,对该病毒进行病毒形态学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为TGEVJL。利用PCR方法克隆出其S基因部分片段,并将该基因序列和推导的氨基酸序列与7个不同来源的TGEV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析,结果表明,各毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和94.8%～98.8%;系统进化树结果表明,TGEVJL株与日本分离的TQ14毒株和西班牙分离的TOY56-165毒株亲缘较近,表明不同地区分离毒株的S基因差异不大。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分子克隆及序列分析

采用RT-PCR法对Ⅰ型DHV A66弱毒株基因组全序列进行了分子克隆与测序.研究结果表明,不含Poly(A)尾巴的A66株的基因组全长为7 704个核苷酸残基,包括626个核苷酸残基的5′端非编码区、6 750个核苷酸残基的开放阅读框和314个核苷酸残基的3′非编码区.应用分子生物学软件将A66株与GenBank公布的其他DHV-Ⅰ全基因序列进行同源性比较分析,结果表明,除了90D和04G两株变异株外,A66株ORF的核苷酸序列与其他各株的同源性在94.3%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在97.3%～99.6%之间,并且A66与C80、JX弱毒株的核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高,在99.4%以上,各毒株氨基酸序列同源性比核苷酸同源性略高.Ⅰ型DHV病毒基因组的一级结构高度保守.     

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因的分子特征

本研究于2011年8月从山东省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行病毒致鸡胚矮小化试验、RT-PCR、动物回归试验等方法证实分离到鸡传染性支气管炎病毒(AIBV),命名为SDLVS株。根据GenBank上发表的AIBV的S1基因序列,用Oligo6.0设计引物,对分离株SDLVS株S1基因进行序列扩增,测序及序列分析。将分离的AIBV毒株与中国常用疫苗毒株、其他血清型参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。SDLVS S1基因由1611个核苷酸组成,编码含537个氨基酸残基的多肽。SDLVS株与55株参考毒株的同源性比较,核苷酸同源性在72.4%～99.6%之间,推导氨基酸序列同源性在71.2%～99.3%之间。从进化树分析中SDLVS株与Mass型参考毒株核苷酸同源性最高,特别是与H120核苷酸同源性最高为99.6%,进化亲缘关系最近,提示这2株毒株的存在可能与长期使用Mass血清型AIBV疫苗,从而产生疫苗的免疫压力有关。     

NDV长春株生物学特性及与国外毒株HN蛋白基因的同源性比较

以新城疫病毒（NDV）长春株接种9日龄SPF鸡胚增殖后,进行了蚀斑纯化（三代）鉴定,差数、蔗糖密度梯度离心提纯和生物学特性鉴定。结果表明,该病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）大于168h,雏鸡脑内致死性（ICPI）为0.25,雏鸡静脉致死性（IVPI）为0,血凝解脱时间超过120h,血凝素热稳定性56℃ 5min 仍具有血凝活性。系统发育进化树分析表明,NDV长春株与La Sota株亲缘关系最近,为弱毒株。参考多株NDV HN基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR一次性扩增出NDV长春株的全长HN基因。将该HN基因插入pKS（-）后,进行了序列测定。序列分析表明,该HN基因苷酸长度为1731bp,编码577个氨基酸,序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基,与国外发表的NDV毒株序列相符,核苷酸同源性为88.1%～98.8%,推导的氨基酸同源性为91.1%～98.8%。     

猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析

采用PCR方法对2011-2013年山西省分离的2株猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）的胸苷激酶（TK）基因进行了克隆和测序,并将其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外主要流行毒株Bartha株、Becker株、Ea株、Kaplan株、LA株、Min-A株、NIA-3株、SH株、SL株和Yangsan株进行了同源性分析。序列分析结果表明,核苷酸同源性分别为99.7%、99.6%、99.8%、99.7%、99.7%、94.4%、99.1%、57.2%、99.5%、99.7%;氨基酸同源性分别为99.1%、99.1%、99.7%、99.4%、99.4%、90.3%、98.1%、49.7%、98.8%、99.1%。另外在核苷酸序列中起始密码子上游有3段GC box的序列,终止密码子下游有多聚腺苷加尾信号AATAAA;TK基因均由320个氨基酸组成,氨基酸序列中有疱疹病毒TK基因共同的保守序列-R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-。     

伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析

参考Genebank发表的伪犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）的gI和gE基因序列，自行设计并合成了两对引物，对PRV上海株（PRV－SH）进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分析，均呈现一条约960bp和1740bp的条带，将其克隆入pGEM-T-easy载体中，进行了序旬测定，将PRV－SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%，氨基酸的同源性为91.3%，证实为gI基因，将PRV－SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较，结果显示，该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%；的氨基酸序列与Ea株，Rice株和I型单纯疱疹病毒（HSV－1）17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆及序列分析

参照已发表的猪圆环病毒II型(Porcinecircovirustype2,PCV2)基因序列,设计合成了一对引物,对PCV2北京株(Shy)ORF2基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约720bp的特异条带,将其回收后克隆入pGEM-TEasy载体中,并进行序列测定,与加拿大PCV2株(基因序列号AF027217)ORF2基因比较发现,核苷酸的同源性达99.3%,氨基酸的同源性为98.3%,证实为PCV2-ORF2基因。     

小反刍兽疫病毒四川简阳株N基因的系统进化分析

为了调查小反刍兽疫病毒四川简阳株(SCJY株)的分子遗传特征,我们对四川简阳发病羊鼻拭子中的小反刍兽疫病毒N基因进行了遗传进化分析。通过RT-PCR、克隆测序获得SCJY株N基因序列,使用DNASTAR软件将其与GenBank中的15条参考株序列进行同源性比对,使用MEGA6软件进行系统进化分析。结果显示:SCJY株N基因序列全长1578nt,与参考株的核苷酸同源性为88.9%～100%,氨基酸同源性为92.8%～100%,与2013～2014年小反刍兽疫中国流行毒株高度同源;系统进化分析将16个毒株N基因划分为4个谱系,SCJY株属于Ⅳ系。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株FS的分离鉴定与全基因组序列分析

从一例疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病例中分离到一株病毒,经全基因组测序分析可知此毒株在Nsp2部位发生了30个氨基酸的缺失,GP5蛋白相对保守。本毒株与VR-2332同源性达到88.7%,与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源性为58.5％,与国内报道的JN-HS毒株相似性最大,核苷酸同源性达到98.8%。