牛胎儿皮肤成纤维细胞体外培养及其特性研究

该试验研究了牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化方法及其生长特征.牛胎儿皮肤细胞贴壁传代2～4次.可成功获得均一稳定的成纤维细胞群体.取传至4代的牛胎儿皮肤成纤维细胞进行细胞计数,并绘制其生长曲线.     

绵羊肺腺瘤kras和其他相关基因突变的检测

为了解绵羊肺腺瘤与基因突变的关系,从绵羊肺腺瘤病毒感染的病羊肺脏组织扩增kras、nras、pik3ca、egfr、p53基因突变频率高的位点所在外显子核苷酸序列,应用PCR-SSCP技术和测序分析检测基因突变。结果显示,nras、pik3ca、egfr基因未检测到突变。2个阳性样品kras基因第1外显子检测出突变,核苷酸突变为点为35G→T,编码的氨基酸位于第12密码子为12G→V。1个阳性样品p53基因第7外显子检测出突变,核苷酸突变位点为825T→C,编码的氨基酸未发生突变,依然是C。为绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)分子致病机制的研究提供了参考资料。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99．4％,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971．1的核苷酸同源性为90．4％。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。     

1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒的序列测定与分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。     

羊Ⅱ型肺泡上皮细胞的分离培养及鉴定

为改进羊肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离和培养技术,本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离纯化了山羊肺泡Ⅱ型上皮细胞,碱性磷酸酶染色检查表明Ⅱ型细胞占90%以上,台盼蓝染色活细胞为95%以上.羊肺泡Ⅱ型上皮细胞分离纯化方法的建立,为今后体外分离培养绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的探索性工作奠定了基础,也为研究肺纤维化及肺癌发病机理等重大课题提供了重要的技术支持.     

内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。     

绵羊、山羊内源肺腺瘤病毒启动子甲基化修饰检测

为分析绵羊和山羊内源性肺腺瘤病毒启动子甲基化修饰状况,参照绵羊、山羊内源性肺腺病毒gag基因上游非编码区序列CpG岛设计特异性甲基化引物,采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测了5只绵羊和5只山羊胎儿的肺脏、皮肤、血液基因组内源性病毒基因启动子区甲基化情况.结果表明：山羊和绵羊肺脏、皮肤、血液基因组中均存在甲基化和非甲基化的内源性肺腺瘤病毒启动子.     

绵羊肺腺瘤PCR诊断方法的建立及应用

利用特异性PCR方法实现对绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)快速精确诊断和病毒类型的分析.参照GenBank中公布的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列,针对病毒env基因YXXM基序设计了特异性PCR引物,建立了特异性PCR检测方法.成功扩增出病毒囊膜基因(env)多变区序列片段(ST)通过序列比对确定病毒类型.此方法操作简便,可用...     

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达

为探讨绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(OPAV-Env)引起肺泡Ⅱ型上皮恶变的机理,将真核表达质粒pcDNA3.1-env用体内转染试剂经尾静脉转染到幼龄大鼠体内,用RT-PCR及免疫组化法检测绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达,并采用SSCP法及基因克隆法结合序列分析检测H-ras基因是否发生突变.结果显示,绵羊肺腺瘤病...