常见耐药基因多重PCR方法的建立及用于禽致病性大肠杆菌耐药性监测

本研究旨在建立β-内酰胺类、四环素类、氨基苷类、酰胺醇类、磺胺类抗菌药物耐药基因的多重PCR检测方法，用于耐药基因的快速检测。根据GenBank公布的上述5类抗菌药物的耐药基因序列，设计17对特异性引物。通过优化PCR体系和反应程序，建立4组耐药基因（cat+floR+tetB+tetC；dfrA12+sul2+sul1+bla_CTX-M+bal_TEM-1；aac3+aph3+aadA1+strB；tetA+cmlA+strA+sul3）的多重PCR反应体系。然后，检测多重PCR方法的特异性和敏感性。利用建立的多重PCR方法检测42株禽致病性大肠杆菌的耐药基因，同时，检测其耐药性，比较分析耐药基因和耐药表型之间的相关性。结果显示，建立的4组多重PCR体系可有效扩增出17个耐药基因片段，测序结果表明特异性较好。敏感性结果表明，4组多重PCR体系的菌液敏感性分别为10³、10⁴、10⁴和10⁵CFU。禽致病性大肠杆菌分离株的耐药基因多重PCR和单重PCR检测结果一致，其携带的耐药基因和耐药表型的符合率为92.86%。本研究建立的耐药基因多重PCR方法能简便、快速地检测常见的耐药基因，可用于耐药基因的传播、流行调查。     

宠物犬源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的检测及药物敏感性分析

floR是氟苯尼考特异性耐药基因之一,当前宠物犬源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的研究报道很少,故本试验利用PCR方法对宠物犬源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR进行检测,并采用微量肉汤稀释法测定宠物犬源大肠杆菌对10种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,20株宠物犬源大肠杆菌中floR耐药基因的阳性菌株数为9株,阳性检出率为45%;对氟苯尼考的耐药率为65%,并呈现3~7重的多重耐药性。结果表明,随着氟苯尼考在兽医临床的广泛应用,其耐药率越来越高,需不断加强对氟苯尼考等抗菌药物的耐药性监控。     

倒扣草水煮液和抗菌药联用对3株多重耐药大肠杆菌的体外抑菌效果研究

倒扣草是一种抗炎、抗菌、抗肿瘤的常见中药,为了倒扣草水煮液对3株多重耐药大肠杆菌的抑菌效果,采用微量肉汤二倍稀释法测定倒扣草水煮液与头孢曲松钠、阿莫西林、头孢噻呋钠、环丙沙星、克林沙星、磷霉素、氟苯尼考、利福平等抗菌药的最小抑菌浓度(MICs);采用微量棋盘稀释法测定1/2MIC倒扣草水煮液与不同浓度抗菌药联用时的最小抑菌分级指数(FICI);结合3株多重耐药大肠杆菌的MICs与FICI值,选取3种耐药基因超广谱β-内酰胺类耐药基因CTX-M、氟苯尼考耐药基因floR、磷霉素fos A3进行PCR扩增。结果表明,倒扣草对多重耐药大肠杆菌具有一定的抑菌效果,其中对产CTX-M型大肠杆菌E1,倒扣草水提液与头孢噻肟、环丙沙星、利福平呈现相加效应;对产floR型大肠杆菌E2,倒扣草水提液与氟苯尼考、头孢噻肟、克林沙星、利福平呈现协同或相加效应;对产CTX-M型大肠杆菌E3,倒扣草水提液与磷霉素、利福平、黏杆菌素、痢菌净及氟苯尼考呈现协同或相加效应。倒扣草水煮液与部分抗菌药联用可降低抗菌药对多重耐药大肠杆菌的最小抑菌浓度(MICs),对畜牧业减少或降低抗菌药的使用有着实际意义。     

大肠杆菌耐药性及氟苯尼考耐药基因floR的研究

本实验对某地养殖场猪源和鸡源大肠杆菌的耐药性及氟苯尼考耐药基因flo R进行分析,旨在了解我国大肠杆菌的耐药现状,以降低对养殖业的危害,减少菌株耐药性的传播,为兽医临床用药及兽药管理提供科学依据,为新型抗菌药物的研制奠定理论基础。采用国标法分离鉴定大肠杆菌,肉汤微量稀释法进行药敏实验,PCR法检测氟苯尼考flo R基因,膜过滤法进行转化接合实验。结果表明:共分离大肠杆菌293株,分离率为73.3%,其中猪源157株,鸡源136株;大肠杆菌对磺胺类、四环素类和氨基糖苷类药物的耐药性相对严重,对氯霉素类、氟喹诺酮类和β-内酰胺类药物相对敏感;与欧盟EUCAST标准相比,该地区大肠杆菌的MIC分布出现明显右移现象;80%以上的大肠杆菌均为多重耐药菌株,以8重和9重耐药菌株为主;氟苯尼考耐药基因flo R携带率为61.2%,flo R基因可以在菌株间相互转移。样品采集地区养殖场大肠杆菌污染严重,耐药种类逐渐增多,多重耐药现象严重,质粒介导的耐药基因可以在菌株间相互转移。     

猪鸡致病性大肠杆菌沙门菌对β-内酰胺类药耐药表型和基因检测

本试验指130株细菌对β-内酰胺类药物头孢噻吩、头孢西丁、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟等的耐药表型进行研究。结果大肠杆菌及沙门菌对β-内酰胺类耐药率较高:头孢噻吩83.5%、头孢他啶63.4%。敏感率较高的:头孢曲松93.2%、亚胺培南97%、头孢吡肟100%。采用本实验室建立的三重PCR方法,检测β-内酰胺类药物CTX-M、SHV和TEM耐药基因,TEM的检出率最高82%(82/130),SHV的检出率34%(34/130)、CTX-M检出率23%(23/130)。耐药基因和耐药性比较表明,大肠杆菌及沙门菌对β-内酰胺类药物耐药表型与耐药基因型符合率较高,能很好的反映细菌耐药情况并给临床用药提供参考。     

养殖废水产ESBLs大肠杆菌多重耐药性及耐药基因检测

为研究养殖废水中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌的分布及其多重耐药性与耐药基因携带情况,本研究对泰安市污水处理厂污水中分离的50株产ESBLs大肠杆菌阳性菌株采用纸片扩散法测定其对19种常见药物的耐药表型。针对产ESBLs菌株的耐药基因设计6对特异性引物,对ESBLs阳性菌株采用PCR方法检测其耐药基因。结果显示,50株产ESBLs大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素表现出较强的耐药性,其中对氨苄西林、头孢噻吩、头孢噻肟呈100%的耐药性;对非β-内酰胺类抗生素同样呈一定耐药性;并且呈多重耐药性。PCR扩增结果显示,分离菌株均含有bla_(TEM)、bla_(CTX-M)基因,有5株含有qrB基因,32株含有qrS基因,有2株不含blaSHV基因,50株菌株均不含qrA基因。本研究表明:养殖场排放的污水已被产ESBL大肠杆菌严重污染,污水是这些耐药基因重要的存储库。且养殖污水中耐药菌通过污水排放最终进入到水环境中,其耐药基因可能在水环境的细菌之间进一步扩散,导致产ESBLs大肠杆菌表现出多重耐药性,同时这些产ESBL大肠杆菌会反过来再次感染动物,造成耐药菌在动物间的传播,甚至造成严重的感染。本研究对水是这些耐药基因重要的存储库这一结论提供了实验佐证。     

山东省某鸭场大肠杆菌病病原的分离鉴定与耐药性分析

致病性大肠杆菌耐药程度日益严重,已对畜牧业生产安全和公共卫生安全构成了较大威胁。2020年山东省某鸭场发生疑似禽大肠杆菌病,大批雏鸭死亡。为精准诊断和了解病原耐药情况,对病死鸭心脏组织病料进行细菌分离,并对分离菌进行16S rDNA鉴定、抗菌药物敏感性测定和β-内酰胺类耐药基因bla_CTX-M检测。结果显示:从2只病死鸭心脏组织中分离出CD4-10、CD4-12等2株大肠杆菌;2株分离菌均对头孢噻肟、头孢噻呋、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素、强力霉素、萘啶酸和氟苯尼考高度耐药,对多黏菌素、美罗培南和磷霉素敏感,其中CD4-12菌株还对阿米卡星和庆大霉素表现敏感。2株菌均携带bla_CTX-M-1G耐药基因,未携带bla_CTX-M-9G耐药基因。结果表明,该鸭场大批雏鸭死亡是由多重耐药的大肠杆菌感染引起的,且分离菌耐药十分严重,因其携带bla_CTX-M-1G基因而对β-内酰胺类药物耐药。本研究为当地禽大肠杆菌病临床用药、疫苗制备及肉鸭科学养殖提供了信息支持。     

广东地区水禽源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性及耐药基因检测

为了调查广东地区水禽源大肠杆菌对β-内酰胺类抗菌药的耐药性和耐药基因的流行情况,本试验于2012—2014年从广东地区患病水禽中成功分离鉴定243株大肠杆菌,采用琼脂二倍稀释法测定大肠杆菌分离株对4种β-内酰胺类药物的敏感性,并通过PCR方法检测耐药株的耐药基因blaCTX-M、blaTEM和blaOXA。药敏试验结果显示,广东各地区的分离株对氨苄西林和阿莫西林耐药率较高,耐药率为80.00%~100.00%;而对头孢他啶和头孢噻呋耐药率较低,耐药率为9.09%~50.00%。PCR检测结果显示,在4种药物的耐药菌株中,耐药基因blaCTX-M、blaTEM和blaOXA的检出率分别为88.46%~90.87%、67.21%~88.52%和51.28%~59.02%。结果表明,水禽大肠杆菌对β-内酰胺类药物普遍具有耐药性,其中青霉素类尤为严重。blaCTX-M、blaTEM和blaOXA基因为广东地区水禽源大肠杆菌携带的主要耐药基因,且耐药基因的普遍存在与临床日益严重的耐药现象有着很大的关系。     

重庆地区鸡源大肠杆菌、沙门氏杆菌耐药性的测定与分析

为了掌握重庆地区养鸡场大肠杆菌、沙门氏杆菌的耐药情况,试验选取10种抗生素对分离到的110株大肠杆菌、14种抗生素对分离到的8株沙门氏杆菌进行药敏试验,测定大肠杆菌的耐药基因,比较分析大肠杆菌耐药表型与耐药基因的关系。结果表明:多黏菌素对所有大肠杆菌均敏感,4株大肠杆菌对环丙沙星、庆大霉素、头孢噻肟耐药,20株大肠杆菌对恩诺沙星耐药,24株大肠杆菌对卡那霉素耐药,28株大肠杆菌对链霉素耐药,40株大肠杆菌对阿莫西林、氟苯尼考耐药,72株大肠杆菌对磺胺甲口恶唑耐药;在110株大肠杆菌中80. 00%为多重耐药株,其中对2种抗菌药物耐药占32. 73%,对7种药物耐药占7. 27%,多重耐药性主要集中在二到四重,占63. 64%。沙门氏杆菌对环丙沙星、氨曲南、头孢噻肟敏感;而对氯霉素、磺胺异口恶唑、氨苄西林、四环素、复方新诺明、头孢唑啉、多西环素均耐药; 8株沙门氏杆菌中100%为多重耐药株,其中对2种抗菌药物耐药占12. 50%,对8种药物耐药占12. 50%,多重耐药性主要集中在四到八重,占87. 50%。大肠杆菌药敏试验和耐药基因的检测结果表明,磺胺类耐药基因与耐药表型符合率较高,为75. 00%(72/96)。β-内酰胺类中头孢噻肟耐药基因与耐药表型符合率较低,为6. 78%(4/59);阿莫西林耐药表型与耐药基因符合率为67. 80%(40/59)。大部分检测的基因在受试菌株中具有较高的流行性,表明这些基因在编码受试菌株耐药性中发挥非常重要的作用。说明分离的大肠杆菌沙、门氏杆菌耐药性十分严重。     

犊牛肺炎大肠杆菌的分离鉴定、耐药性及致病力检测

为确定新疆石河子地区某规模化牛场表现为呼吸道症状病死犊牛的细菌性病原，本研究采用常规细菌分离、PCR及生化鉴定方法从采集的病牛组织中分离并鉴定病原菌，采用PCR方法对其系统进化分群、采用K-B纸片扩散法检测细菌的药物敏感性、采用PCR方法分别检测细菌的耐药基因和毒力基因，经腹腔注射菌液进行小鼠的致病性试验，对分离菌株进行生物学特性研究。分离及鉴定结果显示，从病死犊牛的肺脏分离鉴定出的2株大肠杆菌(E1和E2)分属于A群和B1群；药敏试验结果显示两株分离菌对青霉素、阿莫西林、头孢他啶、头孢唑啉、头孢拉定、头孢哌酮、美罗培南、链霉素、妥布霉素、多西环素、麦迪霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、替考拉宁、克林霉素耐药；且2株分离菌均检测到β-内酰胺类的blaTEM、喹诺酮类的aac(6’)-Ib、gyr A共3种耐药基因以及crl、csgA、fimH、pap、motA、hlyE、iucD、omp A、espA、Lux S、fyu A、pta共12种毒力基因；分离菌株耐药基因与耐药表型的结果表明分离菌株表现较强的多重耐药现象；小鼠的致病性试验结果显示分离菌株均为致病性大肠杆菌，E1菌株感染小鼠在32 h...     

河南省部分地区猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX-M、mcr-1的分子流行病学调查

为掌握河南省猪源大肠杆菌耐药基因floR、CTX-M、mcr-1的分布和流行情况，对2013-2018年从河南省内分离的856株大肠杆菌进行floR、CTX-M、mcr-1等三种耐药基因筛查检测，调查其分布特征，并对猪源大肠杆菌耐药基因在郑州、开封、焦作、许昌四个地区的分布和流行趋势进行了分析研究。结果显示，2013-2018年floR基因的检出率一直保持在较高水平，CTX-M基因的检出率持续增长，mcr-1基因的检出率在2014年达到最高，之后逐年下降，直到2018年未检出，并且不同地区耐药基因的流行趋势有一定差异。     

Detection of florfenicol resistance genes in Riemerella anatipestifer isolated from ducks and geese

The cat gene, coding for chloramphenicol acetyltransferase has been reported for conferring the chloramphenicol resistance for Riemerella anatipestifer. Chloramphenicol acetyltransferases, however, are unable to inactivate florfenicol. In this study, 66 R. anatipestifer isolates were investigated for their susceptibility to chloramphenicol and florfenicol and the presence of floR gene. Results showed nine florfenicol intermediate or resistant R. anatipestifer isolates were all floR positive. The expression of floR gene in E. coli and inhibition studies with PAβN indicated that the floR gene was as an efflux pump conferring resistance to both chloramphenicol and florfenicol. Southern hybridization revealed the floR was located in the plasmid DNA of five isolates and in the chromosomal DNA of four isolates. Furthermore, two novel floR-carrying plasmids designated pRA0726 and pRA0846 were sequenced completely. pRA0726 was 11,704 bp in size with 10 putative open reading frames which included the floR, catB and bla(OXA-209) resistance genes. The most differences between sequences of pRA0846 and pRA0726 were the absence of a bla(OXA-209) gene and the deletion of 321 nucleotides of orf1 in pRA0846. Plasmid curing tests demonstrated that pRA0726 carried functional coding proteins for resistance to phenicol and β-lactam antimicrobials. To the best of our knowledge, this is the first report of presence of the floR and bla(OXA-209) resistance genes in R. anatipestifer.     

Plasmid-mediated florfenicol resistance in Mannheimia haemolytica isolated from cattle

The aim of this study was to analyse a florfenicol-resistant Mannheimia haemolytica isolated from a calf to determine the genetic basis of its florfenicol-resistance. The antimicrobial susceptibility and plasmid content of the isolate were determined. A florfenicol resistant plasmid carrying the floR gene was identified by PCR and transformed into Escherichia coli JM109 and HB101 strains. The plasmid was then mapped and sequenced completely. The isolate was resistant to chloramphenicol, florfenicol, oxytetracycline, kanamycin, dihydrostreptomycin, nalidixic acid, ampicillin, and amoxicillin; it carried a floR plasmid of 7.7kb, designated pMH1405. The mobilisation and replication genes of pMH1405 showed extensive similarity to the 5.1-kb pDN1 plasmid from Dichelobacter nodosus and the 10.8-kb pCCK381 plasmid from Pasteurella multocida. An adjacent 2.4-kb segment was highly homologous to the TnfloR region of the E. coli BN10660 plasmid. A plasmid-mediated floR gene was responsible for florfenicol resistance in the bovine respiratory tract pathogen M. haemolytica. The pMH1405 plasmid is the smallest floR-carrying plasmid reported to date. To the best of our knowledge, this is the first report of a florfenicol-resistant gene in M. haemolytica.     

广西地区禽致病性大肠杆菌的耐药性分析

禽致病性大肠杆菌(APEC)是一种能引起鸡、火鸡和其他鸟类肠外感染的致病性大肠杆菌,可以导致肉鸡气囊炎、败血型全身感染、蜂窝织炎和蛋鸡输卵管炎、腹膜炎。为了了解广西地区禽致病性大肠杆菌的耐药表型以及耐药基因的携带情况,本实验室对2019年从广西分离到的69株APEC采取K-B药敏纸片法进行药敏试验,药敏结果显示,69株APEC对氧氟沙星(56.5%)、恩诺沙星(69.6%)、氟苯尼考(79.7%)、氨苄西林(91.3%)、四环素(98.6%)耐药率较高,而对美罗培南、丁胺卡那霉素、呋喃妥因均不耐药;其中,多重耐药现象严重,对10种抗菌药物以耐4种、5种、6种的情况居多。同时用PCR扩增的方法对其耐药基因,包括碳青霉稀类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、黏菌素类、喹诺酮类、四环素类在内的6大类共计17种耐药基因进行了检测。特别值得关注的是,发现了7株携带mcr-1基因的多黏菌素耐药APEC。药敏纸片法检测菌株的耐药表型和耐药基因存在一定关联度。本研究可为养禽场临床用药提供参考,同时为减缓耐药菌传播、降低对人类健康和公共卫生安全威胁提供依据。     

山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

试验旨在了解山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的污染状况及耐药情况。选择山东省3个地区的规模化奶牛场共采集227份牛奶样品,采用细菌学方法对大肠杆菌进行分离鉴定,用微量肉汤稀释法检测分离菌对11种常规抗菌药物的敏感性,采用PCR方法对常见的13种耐药基因、8种毒力基因和Ⅰ类整合子基因盒结构进行分析。结果显示,从227份牛奶样品中共分离出71株大肠杆菌;大肠杆菌对1种及1种以上抗菌药耐药的菌株达到77.5%,多重耐药率为15.5%,其中对多黏菌素耐药率为52.2%,对阿莫西林-克拉维酸耐药率为39.4%,而所有菌株均对新霉素表现为敏感。PCR检测耐药基因、毒力基因和Ⅰ类整合子结果显示,β-内酰胺类耐药基因中blaTEM基因携带率为100%,其中全部为blaTEM-1基因,blaCTX-M基因携带率为32.4%,其中主要为blaCTX-M-15基因,没有检测到blaSHV、blaOXA基因;多黏菌素的耐药基因mcr-1携带率为29.6%;喹诺酮类耐药基因中aac(6’)-Ⅰb-cr基因携带率为29.6%,qnrB基因携带率为20.8%,没有检测到qnrA和qnrC耐药基因;对8种毒力基因检测分析结果显示,仅Hly毒力基因没有被检出,Ecs3703、Irp2基因的检出率较高,分别为90.1%和63.4%,71株大肠杆菌中共有11株携带Ⅰ类整合子,检出率为15.5%,11株大肠杆菌携带6种耐药基因盒结构,最主要的耐药基因盒排列为dfr17-aadA5。本研究结果表明,山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的耐药现象严重,携带毒力基因Ecs3703、Irp2的大肠杆菌可能是引起奶牛乳房炎的致病菌,Ⅰ类整合子的检测在细菌耐药性与基因携带率方面发挥着关键作用,可为临床预防和治疗奶牛乳房炎大肠杆菌病提供理论依据。     

鸭源致病性大肠杆菌耐氟苯尼考floR基因的克隆与序列分析

为调查鸭源致病性大肠杆菌氟苯尼考耐药基因floR的存在情况,利用PCR对20株临床分离的耐氟苯尼考的致病性大肠杆菌进行floR分子检测,分子检测结果显示,全部菌株floR基因阳性;对其中2株大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因floR进行了克隆和测序,结果表明,鸭源大肠杆菌floR基因片段的克隆测序结果与预期所得片段结果相符,长度为753 bp,2株鸭源大肠杆菌floR基因的同源性为99.6%,与牛源、鸡源等floR基因的同源性为84.8%~99.9%。系统发育分析发现,2株鸭源大肠杆菌floR基因不在同一支上,亲缘关系较远,表明floR基因的亲缘关系与该基因的来源动物无关。     

多粘菌素耐药基因mcr-1的研究进展

多粘菌素耐药基因mcr-1由1626个核苷酸序列组成,其主要作用是介导肠杆菌科细菌对多粘菌素产生抗药性。mcr-1基因可携带完整的ISApl1或ISApl1片段,翻译一段由541个氨基酸组成具有介导磷酸乙醇胺转移作用的酶。mcr-1能整合于质粒,可以随质粒在不同细菌中水平传播,甚至可以与其他的耐药基因共同存在于同一质粒,表达后产生多种耐药机制。mcr-1基因介导多粘菌素类药物耐药,但并不耐受目前所有的抗生素。本文对mcr-1基因的发现、分布、流行及耐药性等研究进展进行综述,以期为人类共同遏制多粘菌素类药物耐药基因的流行,及抗生素的安全用药提供可参考依据。     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

我国鸡源沙门氏菌的血清型分布和对黏菌素耐药性的研究

黏菌素是目前临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的重要药物之一,mcr-1基因的携带可介导黏菌素耐药性的产生和扩散。鸡源沙门氏菌作为重要的食源性病原菌,其血清型分布、对黏菌素的耐药性及mcr-1基因的携带对于公共卫生安全具有重要意义。研究对2014-2016年从全国12个省份成鸡分离的450株沙门氏菌进行了血清分型;用微量肉汤稀释法进行了对黏菌素的MIC检测;并用PCR方法对mcr-1基因的携带情况进行了调查。结果表明,鸡源沙门氏菌的优势血清型以肠炎、鸡白痢和鼠伤寒为主;肠炎沙门氏菌对黏菌素的耐药性最强(62.9%),其次为鸡白痢(50.5%)和杜伊斯堡(38.1%);鼠伤寒沙门氏菌对黏菌素最敏感(仅7.1%的菌株耐药);未检测出mcr-1基因阳性的沙门氏菌。研究结果为鸡源沙门氏菌感染的防控以及兽医临床黏菌素的使用和风险评估提供了技术参考。