牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列，应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２，分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带，证     

RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒

用２对已发表的引物和１对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｈ１２０株进行ＲＴ－ＰＣＲ,分别获得了Ｓ１基因上与引物设计相一致的１７２０、２２８、６０２ｂｐ的扩增片段。用自行设计的引物对７个毒株（Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｍ４１、Ｃｏｎｎ、Ｇｒａｙ、Ｔ、Ｈｏｌｔｅ）和５个分离株（宜毒、上毒、云毒、ＨＫ、１１８）的含毒尿囊液或纯化病毒进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果除Ｈｏｌｔｅ株和２个分离株（宜毒、云毒）外,其余均成功地扩增出６００ｂｐ的片段。用１．７、０．２、０．６ｋｂ３对引物对６个ＩＢＶ毒株和６个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行ＲＴ－ＰＣＲ,结果３对引物分别扩增出３、５、９株ＩＢＶ,同时可将不同血清型的１２个ＩＢＶ株分成６种基因型。将ＩＢＶ分离株ＨＫ与标准株Ｍ４１经ＰＣＲ扩增、ＨａｅⅢ和Ｈｉｎｄ酶切、ＲＦＬＰ分析,表明属同一马萨诸塞血清型。３株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）在鸡胚中繁殖,ＰＣＲ最早检出的时间为２０～２４ｈ。ＲＴ－ＰＣＲ提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鉴定

合成了 １ 对能对伪狂犬病病毒（ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ（ｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）基因＋ １１９～＋ １ ０７１区进行特异扩增的引物,用猪 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株细胞培养物提取的基因组作模板,扩增出 ９５３ ｂｐ 长的片段,用地高辛标记该片段作探针,通过 Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ 杂交,从克隆有 Ｐ Ｒ Ｖ 鄂 Ａ 株的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的重组质粒中钓出含 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ。对 ｐ Ｓ Ｔ Ｋ 进行酶切分析,绘制了含 Ｔ Ｋ 基因的 Ｂａｍ Ｈ Ｉ片段的图谱,通过测序得出了 Ｔ Ｋ 基因的全序列。将该序列与 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｉ Ａ３ 株 Ｔ Ｋ 基因进行比较,发现鄂 Ａ 株的 Ｔ Ｋ 基因存在变异。     

鸡传染性法氏囊病病毒野毒株VP2基因高可变区酶切位点分析

参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒（ Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ）００２７３ 毒株基因组序列设计的 １ 对引物,位于 Ｖ Ｐ２ 高可变区两端,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ,扩增了 ５ 个 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 山东分离株 Ｖ Ｐ２ 基因的 ６０７～１ ０８０ 位核苷酸片段（ａａ２０３～３０６）。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经纯化后,分别用 Ｄｒａ Ⅰ、 Ｓａｃ Ⅰ、 Ｓｓｐ Ⅰ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓａｕ３ Ａ Ｉ共 ５ 种限制性内切酶（ Ｒ Ｅ）进行消化处理,结果 ５ 个分离株均为 Ｄｒａ Ⅰ（－ ）、 Ｓａｃ Ⅰ（－ ）和 Ｓａｕ ３ Ａ Ｉ（＋ ）, Ｌ Ｃ２ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（＋ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｊ Ｎ 株为 Ｓｓｐ Ⅰ（－ ）, Ｌ Ｃ１ 和 Ｌ Ｃ２ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（＋ ）, Ｊ Ｎ、 Ｌ Ｌ 和 Ｔ Ａ 株为 Ｐｓｔ Ⅰ（－ ）;５ 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异,而 Ｔ Ａ 株与日本超强毒株 ９０１１ 相类似。５ 个分离株与现用疫苗株对比,至少在 Ｖ Ｐ２ 可变区内存在着一定的差异,这可能是 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 接种免疫鸡群仍然暴发 Ｉ Ｂ Ｄ 的原因之一。     

采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究

建立了检测鸡喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的二温式聚合酶链反应（二温式ＰＣＲ）,根据已报道的ＩＬＴＶ ＴＫ基因的序列,设计并合成了１对引物,用二温式ＰＣＲ对５株不同ＩＬＴＶ ＤＮＡ进行扩增。该对引物对５株ＩＬＴＶ ＤＮＡ均扩增出与预期大小相一致的６４７ｂｐ的扩增产物,而对新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、禽呼肠孤病毒（ＡＲＶ）、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等６种禽病病原体的扩增,     

减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究

从ＧｅｎｅＢａｎｋ的１段含六邻体蛋白基因、蛋白酶基因、ＤＮＡ结合蛋白基因的序列中，应用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计了２对引物。用这２对引物在分别对反应体系成分和聚合酶链反应（ＰＣＲ）试验条件进行优化后，成功地建立了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）套式ＰＣＲ检测技术。对鹌鹑源ＥＤＳＶＱＡＶｃ－９４株、ＡＶ－ｘｂ西北分离株、ＡＶ－１２７国际标准株扩增结果，第一轮ＰＣＲ得到约２９０ｂｐ的特异性片段，第二轮ＰＣＲ得到约９０ｂｐ的片段，与预期２８９ｂｐ、８９ｂｐ的设计相符合。而传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）疫苗株Ｂ８７、鸡亲城疫病毒（ＮＤＶ）Ⅳ系疫苗株（ＬａＳｏｔａ）和正常尿囊液等对照的扩增结果均未显示任何扩增条带，有很好的特异性。所建立的套式ＰＣＲ检测方法具有特异、快速的优点，其灵敏度比常规ＰＣＲ灵敏１００倍，可检测出０．０１ｆｇ的     

鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和中国流行株鉴别诊断的研究

根据国外已发表的ＩＢＶ核蛋白基因序列设计一对特异性引物，引物跨度为１５Ｋｂ，包括整个开放阅读框架。由于疫苗株Ｍ４１在核蛋白基因３′末端非编码区缺失近０２Ｋｂ的基因片段，因此ＲＴＰＣＲ扩增将得到１３Ｋｂ的基因产物。我们应用这对引物扩增９株ＩＢＶ的核蛋白基因，结果表明，除８株ＩＢＶ扩增出１５Ｋｂ的预计大小的基因产物外，疫苗株Ｍ４１则扩增出１３Ｋｂ的基因产物，与实际设计相符。经酶切分析、分子杂交及序列分析鉴定证实我们获得的ＰＣＲ产物为ＩＢＶ的核蛋白基因。     

鸡传染性支气管炎北京地方株S1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应技术从北京地区３株鸡性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎＩ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ１,ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ２和ＰＵＣＩＢＶＳ１－ＢＪ３。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株的构建

将含有牛传染性鼻气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ） Ｔ Ｋ 基因的片段克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ Ｋ 中, 再用 Ｂｇ１ Ⅱ和 Ｓａｃ Ｉ切去 Ｔ Ｋ 基因中３４７ｂｐ 的片段, 获得了含缺失 Ｔ Ｋ 基因的重组质粒, 然后插入 Ｌａｃ Ｚ 报告基因, 构建成转移载体。以脂质体转染法将此转移载体与 Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ Ｂａｒｔｈａ 株在牛肾细胞（ Ｍ Ｄ Ｂ Ｋ） 上共转染, 经过蓝色蚀斑筛选和蚀斑克隆纯化, 获得了能稳定遗传的重组 Ｉ Ｂ Ｒ Ｖ。经 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印迹杂交鉴定, 证实该重组病毒为 Ｔ Ｋ 基因缺失突变株。     

犬冠状病毒分子生物学研究

本研究根据Ｗｅｓｓｅｌｉｎｇ发表的犬冠状病毒（ＣＣＶ）Ｋ３７８株纤突蛋白（Ｓ）基因序列，设计合成了４条寡聚核苷酸引物Ｐ１（１８ｂｐ，１５２０－１５３７ｂｐ），Ｐ２（１９ｂｐ，２０７２－２０９０ｂｐ）和Ｐ３９（２０ｂｐ，２６２１－２６４０ｂｐ），Ｐ４（２０ｂｐ，２９４４－２９６３ｂｐ），以Ｐ１，Ｐ２和Ｐ３，Ｐ４为引物，以美国ＣＣＶＮＬ－１８株反转发产物为模板，建立了ＣＣＶＲＴ－ＰＣＲ方法，并将其中纯     

中国肾型IBV毒株的基因型及其S1基因的巢式PCR

用本研究建立的ＩＢＶＳ１基因的巢式ＰＣＲ方法鉴定了国内５个肾型传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株。以此５个分离株及３个标准毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物（１７４９ｂｐ，含Ｓ１基因）为模板，１对内部引物经巢式ＰＣＲ都获得１７２９ｂｐ的产物，另１对内部引物的巢式ＰＣＲ有大小不同的产物（１６７８ｂｐ或０．５、０．６ｋｂ）。参照以前的ＲＦＬＰ分析结果，探讨了中国肾型ＩＢＶ毒株的基因型状况。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因,并对ＶＰ２基因全序列测定,序列分析和聚类分析,同时将 ＶＰ２基因与真核表达载体 ｐｃＤＮＡ３相连接。结果克隆到 ＶＰ２基因全序列共 １３５６ｂｐ,分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似,同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。     

多聚酶链反应区分血清Ⅰ型MDV强弱毒株

选用血清Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ＿１）基因组中位于１３２ｂｐ正向重复序列两侧的２段寡聚核苷酸为多聚酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对Ⅰ型ＭＤＶ强毒株（京－１株）和弱毒株（Ｍｄ１１／７５Ｃ株）的核酸进行基因扩增。结果显示：该弱毒株核酸基因中含６个或更多个拷贝数的１３２ｂｐ正向重复序列，而强毒株核酸基因中仅含２个，相同引物对Ⅱ型、Ⅲ型ＭＤＶ（ＳＢ－１株，Ｆｃ１２６株）和禽网状内皮组织增生病病毒（ＲＥＶ）核酸作ＰＣＲ扩增，未检出任何核酸片段。     

IBDV野毒株主要结构蛋白基因RT─PCR方法的建立

借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶＶＰ２和ＶＰ３基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因，为ＩＢＤＶ分子生物学研究奠定了基础     

IBDV野毒株主要结构蛋白基因RT—PCR方法的建立

借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２和ＶＰ２基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因，为ＩＢＤＶ分子生物学研究奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆和鉴定

以鸡胚成纤维细胞培养ＩＢＤＶ弱毒疫苗株Ｄ７８，经蔗糖密度梯度离心纯化，电镜下见典型ＩＢＤＶ粒子。用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒基因组，低熔点胶回收，琼脂糖凝胶电泳，可见ＩＢＤＶ典型双节段基因组。根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＩＢＤＶＶＰ２基因的引物。以ＩＢＤＶ基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物，将ＰＣＲ产物适当处理后与经ＳｍａⅠ酶切的ｐＵＣ１９质粒平端连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，在含Ａｍｐ、Χ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的琼脂平板上培养，产生大量白色菌落。挑取白色菌落，经质粒大小比较分析初步筛选到一重组质粒。以重组质粒ＤＮＡ为模板作ＰＣＲ检测和部分酶切分析证实，该质粒为含Ｄ７８ＩＢＤＶＶＰ２基因的重组ｐＵＣ１９     

伪狂犬病弱毒疫苗与野毒株PCR鉴别诊断方法的建立

目前，在国内用于预防猪伪狂犬病的疫苗主要是基因缺失的弱毒（Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１）为了有效地地区弱毒免疫猪和野毒感染猪，本实验分别建立了一种通用和一种鉴别ＰＣＲ诊断方法，根据已发表的伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）ｇＢ，ｇＥ基因的序列，设计并合成了两对引物：ＰＢ１／ＰＢ２和ＰＥ１／ＰＥ２，以疫苗株Ｂａｒｔｈａｋ－６１及野毒株Ｓ，Ｓｕ，Ｆ，Ｌ，Ｙ及闽Ａ（Ｍｉｎ－Ａ）ＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，结果显示用引物Ｐ     

RT—PCR一步法检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

根据已发表的ＩＢＶＳ基因核苷酸序列,自行设计合成了一对跨幅约０．９ｋｂ的引物。该区段包括了Ｓ１基因Ｃ末端的４００ｂｐ和Ｓ２基因Ｎ末端的５００ｂｐ。用该引物对５株ＩＢＶ参考毒株Ｇｒａｙ、Ｍ４１、Ｈ１２０、Ｈ５２和ＭＡ５进行ＲＴ－ＰＣＲ一步法扩增均获得预期的ＰＣＲ产物,该引物的ＲＴ－ＰＣＲ灵敏度检测结果表明,可以检测出０．１１２ｐｇ／μＬ的模板。用该引物对３０个地方分离株进行检测,１８株呈阳性,与鸡胚传代及电镜观察结果一致。     

应用RT—PCR技术扩增禽传染性支气管炎病毒S1基因的研究

选择Ｓ１基因做为目的基因,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术分别扩增１２株以非免疫鸡胚繁殖并通过超速离心浓缩的鸡胚尿囊液中的ＩＢＶ,所用引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列,跨幅为１．７２ｋｂ。结果６株ＩＢＶ毒株（ＳＡＩＢ３、Ｆ、Ｄ４１、Ｈ５２、Ｈｏｌｔｅ）扩增出了长约１．７ｋｂ的Ｓ１基因片段,而另６株ＩＢＶ毒株虽经４次ＲＴ－ＰＣＲ重复后也显阴性。用ＨａｅⅢ内切酶对６个毒株的ＲＴ－ＰＣＲ产物