鸽新城疫病毒北京分离株F基因的遗传进化分析

对一株分离自北京市的鸽源新城疫病毒BJP13株的F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示,F基因核苷酸序列长为1 662bp,编码553个氨基酸,蛋白裂解位点的序列为112RRQKRF117,具备强毒株的序列特征;同源性比较显示,BJP13与国内外不同基因型毒株的同源性在87.9%~99.1%;与新城疫基因Ⅵ型的同源性较高,为93.7%~99.1%,其中与基因Ⅵb亚型中的毒株11和毒株LLN713同源性最高为99.1%,与1996年北京分离株STP96的同源性最低为93.7%;与基因Ⅰ型疫苗株V4株和基因Ⅱ型疫苗株La Sota株的同源性分别为90.3%和88.6%;遗传进化分析显示,北京分离株BJP13与比利时毒株11、4940和中国毒株SDS、LLN713最为接近,位于同一进化分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

6株鸽源新城疫病毒广西分离株F基因的遗传演化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的6株鸽源新城疫病毒F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示:只有1株分离株F基因的ORF全长为1 659 bp,编码552个氨基酸,其他5株分离株F基因的ORF全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,6株分离株的F0蛋白裂解位点的序列均为112RRQKRF117,符合强毒株的序列结构特性;核苷酸同源性比较显示,6株分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为91.3%~99.3%(与比利时分离株11(JX901124)的同源性最高),与其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%~89.2%。与经典强毒株F48E9相比,核苷酸序列同源性为83.6%~84.8%,氨基酸序列同源性为89.2%~92.4%;与Ⅰ型疫苗株V4、I-2相比,核苷酸同源性分别为83.6%~85.1%和82.6%~84.2%,氨基酸序列同源性分别为88.1%~91.3%和87.7%~90.8%;与Ⅱ型疫苗株La Sota和B1相比,核苷酸同源性分别为81.7%~83.9%和82.0%~83.9%,氨基酸序列同源性分别为86.6%~89.9%和86.6%~89.9%。遗传进化分析显示,6株广西鸽源分离株与2011年比利时分离株11(JX901124)和中国毒株SDS、LLN713、BJP13、LJL404、P4的遗传关系最为接近,位于同一进化树分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株做遗传进化分析。12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型。F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6%~91.5%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8%~99%之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9%~91.9%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84%~98.5%之间。氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控。     

10株广西野鸟源新城疫病毒HN基因的遗传进化分析

对分离自广西4种鸟类的10株新城疫病毒(NDV)分离株,进行HN基因的RT-PCR扩增、序列测定和分析,旨在探讨广西野鸟源NDV HN基因的分子进化特征,为科学防控新城疫提供依据。结果显示,10株广西野鸟源NDV分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp,编码571个氨基酸,符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示,2株鹧鸪源NDV分离株与NDV基因XII型同源性高达98.0%～98.1%, 5株斑鸠源和3株鸽子源NDV病毒与NDV基因VI型的同源性高达90.0%～91.9%。遗传进化分析显示,10株广西野鸟NDV分离株与我国经典强毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我国目前应用最广的疫苗株基因型)遗传距离较远。     

三株鸽新城疫病毒新疆分离株F基因序列分析及遗传起源探讨

用RT-PCR方法从3株鸽新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)新疆分离株中扩增出F基因裂解位点前后482 bp片段,将其克隆至pGEM-T Easy载体并进行核苷酸序列测定。用DNAStar软件对分离株的F基因片段与国内外相关的NDV参考株进行比较,结果表明3个分离株之间核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.6%～99.8%和99.4%～100.0%,与其它鸽源NDV F基因相应部分核苷酸及氨基酸序列同源性分别为89.4%～98.1%和90.6%～98.1%,而与国内代表性弱毒疫苗株LaSota毒株和NDV强毒株F48E9的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为86.3%和87.6%及90.0%和92.5%。遗传发育进化树分析表明3个分离株属NDV基因型Ⅵ,与法国株(Pigeon-France-99)、意大利株(Pigeon-Italy-00)形成同一细分支,其核苷酸同源性为97.9%～98.1%,F基因的裂解位点氨基酸序列都为112R-R-Q-K-R-F117,是典型的强毒株共有序列,新疆鸽流行株与欧洲鸽流行株有很近的遗传亲缘关系,为同一基因亚型。对疫病流行时间、新疆独特的地理位置和病毒基因遗传衍化关系等方面进行综合考虑与分析,2000年开始在新疆地区流行的鸽NDV和欧洲国家上述流行株具有共同的遗传起源,推测通过从国外引种或者候鸟迁移等途径传播的可能性较大。     

2021—2022年我国8株鸽新城疫病毒基因组特征

为了解我国最新流行的鸽新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）分子生物学特征,对2021—2022年国家新城疫参考实验室从不同地区鸽群中分离到的8株NDV代表株进行了全基因组测序和生物信息学分析。结果显示：8株鸽NDV基因组长度均为15 192 nt,基因排列方式为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’,其F蛋白裂解位点氨基酸序列均为112RRQKR/F117,呈典型的NDV强毒分子特征;相较于参考序列,代表毒株F蛋白七肽重复区域、融合肽和跨膜区域,以及HN蛋白中和抗原表位、跨膜区域等功能区域均有多处氨基酸变异;代表毒株全基因组核苷酸同源性为91.9%～99.0%,均属于Class Ⅱ基因Ⅵ型病毒,但可分为2个小分支,其中4株属于基因Ⅵ.2.1.1.2.2亚型,另4株属于基因Ⅵ.2.1.1.2.1亚型。结果表明,我国近期流行的鸽NDV具有遗传多样性特征。本研究进一步掌握了我国鸽NDV的遗传进化特点,丰富了鸽新城疫的流行病学信息,为该病的科学防控提供了参考。     

一株鸽新城疫病毒的分离鉴定及F与HN基因序列分析

从广东珠三角地区某鸽场的发病鸽群采样,接种10日龄SPF鸡胚后分离到一株病毒,命名为JP株。系列微量血凝和微量血凝抑制试验结果表明,新城疫病毒(NDV)阳性。测序结果显示,该NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株序列特点;F基因分型表明,JP株属于基因Ⅵ型。Blast结果显示,JP株F、HN基因序列均与基因Ⅵ型pi/CH/LGD/110208株同源性最高,均达99%。同源性比较发现,F和HN基因、蛋白都与基因Ⅵ型新城疫毒株同源性较高,分别为92.5%~99%、95.5%~99.1%和90.6%~98.7%、91.9%~99%,而与国内常用疫苗株B1、La Sota、Mukteswar等同源性较低,分别为83.2%~85.9%、89.2%~91%和79.3%~83.4%、86%~89.5%。分离的JP株属于基因Ⅵ型,并与国内常用疫苗株存在一定的差异。     

一株广西鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及F基因序列分析

为了确定鸽Ⅰ型副黏病毒(PPMV-1)分离株的基因型及遗传变异,试验对广西某鸽场疑似感染PPMV-1的临床样品进行RT-PCR诊断、病毒分离鉴定和人工感染试验,并对分离株进行F基因测序、相似性分析及构建遗传进化树。结果表明:临床样品经RT-PCR扩增可得到特异性目的条带,病毒分离株具有血凝活性并能被特异性新城疫(ND)阳性血清抑制。分离株能引起非免疫鸽发病,发病率和死亡率分别为100%和10%。对分离得到的PPMV-1(命名为pi/CH/GX1026/2016)进行序列分析,该分离株F蛋白的裂解位点为~(112)RRQKR↓F~(117),符合新城疫病毒(NDV)强毒株的特征。pi/CH/GX1026/2016分离株与毒株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015和European turtle dove/Ch/GD/GZ23/2015核苷酸和氨基酸相似性较高,核苷酸相似性分别是99.6%和99.4%,氨基酸相似性分别是99.3%和98.9%;与疫苗株La Sota核苷酸和氨基酸相似性较低,分别是83.8%和88.3%。分离株与基因Ⅵ型NDV毒株Grey heron/Ch/GD/GZ333/2015和European turtle dove/Ch/GD/GZ23/2015遗传关系亲近,与基因Ⅱ型疫苗株La Sota的遗传关系较远。说明pi/CH/GX1026/2016分离株为基因Ⅵ型的PPMV-1,该毒株与NDV常用疫苗株La Sota的遗传关系较远。     

东北地区新城疫流行株的分子生物学特性调查

从东北地区发生新城疫(ND)的病鸡、病鸽和产蛋下降鸡分离到19株NDV，对其融合蛋白(F)基因532bp或280bp片段进行了克隆、测序(在GenBank中的登录号为AY208680～AY208698)，并对各株的F基因序列进行了比较。结果，各毒株之间的核苷酸同源性为83．1％～100％，氨基酸同源性为85．5％～100％；系统发育进化树分析表明，其中2株与疫苗株V4同属基因Ⅰ型，为弱毒株；其余17株为强毒株，其中2株为基因Ⅵ型，其余为基因Ⅶ型。表明东北地区目前由3种基因型的NDV毒株(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所引发，并以基因Ⅶ型为主。另外，对其中的代表毒株APMV1／chiclierl／China／JL-11／02进行了免疫学试验，结果显示，LaSota疫苗的免疫保护效果不理想，可能是LaSota疫苗免疫鸡群发生ND的主要原因。     

2008年我国部分地区新城疫病毒分离株的分子生物学特征分析

从中国部分地区分离到9株新城疫病毒(NDV),采用RT-PCR方法扩增NDV F基因(535 bp),参照国内外已经发表的F基因构建系统进化树。结果:6株吉林分离株和2株山东分离株属于VIId基因型,氨基酸裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,为典型的强毒株特征。吉林分离株之间的核苷酸同源性为93.5%～99.1%,山东分离株之间的核苷酸同源性为99.3%,吉林和山东分离株之间的核苷酸同源性较高,约为93.5%～96.3%。1株安徽分离株属于Ⅰ基因型,氨基酸裂解位点序列为112G-K-Q-G-R-L117,为典型的弱毒株特征,与V4毒株核苷酸同源性为95.7%,与吉林、山东分离株存在一定差异。表明我国新城疫病毒主要以VIId基因型为主,也存在其他基因型的流行。     

2008-2009年部分地区新城疫病毒分离株的进化分析

本研究旨在从分子水平上掌握中国新城疫病毒的变异情况和新城疫的流行规律,对2008-2009年从中国部分省市养殖场分离的9株新城疫病毒毒株,采用RT-PCR方法扩增其F和HN基因,经克隆和测序,对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,9株分离株有8株为基因Ⅶ型,1株为基因Ⅱ型,F基因开放性阅读框架(ORF)为1662 bp,强毒株同La Sota的核苷酸同源性为83.5%~84.2%。HN基因开放性阅读框架(ORF)为1716或1734 bp,强毒株在538位缺失1个糖基化位点。结果表明,近年流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型NDV引起,F和HN基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析，为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考，也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotypeI，APMVx）基因组序列，设计了1对特异性引物，用RT—PCR法分别扩增出病毒各F基因片段，并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明，从猪组织中分离获得1株猪源禽I型副粘病毒，分离株F基因112～117住裂解住点的氨基酸组成为R—R—Q－R—R-F，与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明，分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87．5％和87．4％。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株，属于基因I型是传统型毒株，广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。     

1株鸽新城疫病毒的分离鉴定及分析

本研究自广州市某疑似患新城疫的白鸽养殖场分离鉴定出1株鸽新城疫病毒,命名为GZ-2016株。通过对其F和HN基因的序列分析发现,GZ-2016株属于基因Ⅵ型毒株,其F蛋白具有强毒株裂解位点序列112RRQKR↓F117。除HN蛋白第347位抗原位点由E突变为G外,F和HN蛋白的中和位点、糖基化位点及半胱氨酸残基高度保守。该毒株与我国鸽群及欧洲流行的鸽源基因Ⅵb亚型毒株进化关系密切,F基因和HN基因序列相似性分别大于95%和97%。上述结果表明,基因Ⅵb亚型新城疫病毒在我国和欧洲鸽群中流行,且关系密切。     

六株鸽源新城疫病毒的分离、鉴定及生物信息学分析

新城疫是严重危害世界养禽业的一种禽类传染病。近年来,鸽新城疫的流行越来越严重,引起了养殖户和兽医工作者的广泛关注。本研究在4批发病鸽组织病料中分离到了4株鸽源新城疫强毒株和2株鸽源弱毒株。病毒分离株经鸡胚有限稀释法纯化5次后,新鲜尿囊液用于提取病毒RNA。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。通过对F基因的遗传进化分析发现,4株鸽源强毒株属于ClassⅡ基因Ⅵb亚型,2株鸽源弱毒株与Class II基因II型疫苗株La Sota高度同源。进一步遗传进化分析结果显示,4株鸽源新城疫病毒强毒株与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与欧洲流行株亲缘关系十分相近,而与中国20世纪90年代鸽源分离株遗传距离稍远,因此推测当前鸽源流行强毒株可能源自欧洲。生物信息学分析显示鸽源毒株HN蛋白345~353位的一个线性抗原表位发生了改变,而血清学实验显示La Sota疫苗株和鸽源毒株的交叉血凝抑制存在明显差异,暗示鸽源毒株已经发生了抗原性变异。因此,使用鸡疫苗株La Sota免疫鸽存在免疫失败的风险,需要研发鸽专用新城疫病毒疫苗用于鸽新城疫的防疫工作。     

广东部分地区鸽禽Ⅰ型副黏病毒分子流行病学研究

为了解广东近年来鸽禽Ⅰ型副黏病毒(PA/PMV-Ⅰ)基因变异情况,为新型疫苗毒株的筛选以及PA/PMV-Ⅰ的免疫防制提供依据,我们对广东不同地区在1999年～2007年发生PA/PMV-Ⅰ鸽群开展流行病学调查、病原分离鉴定,从中筛选出8株病毒进行F基因RT-PCR扩增、测序和相似性分析.结果表明,8株PA/PMV-Ⅰ之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为83.7%～99.9%和87.9%～99.6%,其中P199902-1株和P200201-1株之间的氨基酸相似性最高达99.6%,与其他6株的氨基酸相似性则相对较远.遗传进化树分析结果表明,P199902-1、P200201-1、P200301-5、P200401-3株和P200705-1株属于基因Ⅵ型;P200001-2株属于基因Ⅱ型,与疫苗株LaSota-46株亲缘关系较近;P200103-5与P200603-5株属于基因Ⅶ型与国内广西等地的鸡源NDV流行株Chicken/Gx/14/2005和NDV0210149株亲缘关系最近.     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.     

鸡新城疫病毒河北分离株F基因的分子特性分析

通过毒力测定、RT-PCR及F基因的序列测定与遗传进化分析,对2005-2008年从河北省部分地区的发病鸡群中分离到的10株新城疫病毒（NDV）进行了研究。各分离株经典毒力测定结果显示：MDT在37.6～54.4h之间,ICPI在1.71～2.0之间,IVPI值在2.16～2.8之间,均为新城疫病毒强毒株特征。F基因的序列测定表明,分离株之间的核苷酸序列具有77.4%～98.0%的同源性,与疫苗株Lasota的同源性为87.0%～98.9%,与国内标准强毒株F48E9同源性为89.7%～98.9%。推导其氨基酸序列分析表明,8个分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112 R-R-Q-K-R-F117,具有NDV强毒株特征,与毒力测定结果相符,2个分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112 G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株特征相符。F基因分型和同源性比较显示：目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主（占70%）,同时兼有基因Ⅱ型（占20%）和基因Ⅸ型（占10%）。     

一株Class Ⅰ新城疫病毒中国分离株分子特性的研究

摘要：对从健康家鸭中分离到的一株Class Ⅰ新城疫病毒分离株Duck／China／08—004／2008进行了遗传进化特性研究。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段。并进行了克隆与序列分析。序列测定结果已经登录到GenBank,登录号为EU589149。该分离株F蛋白裂解位点的组成为112E—Q—Q—E—R—L117,具有典型新城疫弱毒株的分子特征。同源性分析表明其与国内普遍使用的弱毒疫苗株LaSota和V4核苷酸的同源性较低（分别为55．4％和57．7％）。通过构建F基因的遗传进化树,结果表明该分离株在分类地位上属于Class Ⅰ,与我国目前普遍使用的弱毒疫苗株LaSota（Class Ⅱ中的基因Ⅱ型）和V4（ClassⅡ中的基因Ⅰ型）处在不同的进化分支。通过构建57株ClassⅠ新城疫病毒的遗传进化树．表明本分离株与近年来香港活禽市场分离株较为类似．同属于基因3型。     

我国部分地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析

于2008～2013年从江苏、山东、河南、河北等地分离鉴定出45株H9N2亚型禽流感病毒,采用PCR扩增分离株HA基因,并进行HA基因测序、核苷酸同源性分析及遗传进化分析.同源性比较结果显示:45个毒株的HA基因与我国现有疫苗株的HA基因核苷酸同源性为89.1％～94.4％,其中与HP株和F98株的HA基因核苷酸同源性分别为91.3％～94.4％和89.1％～92.0％.遗传进化分析结果显示,分离株的HA基因均属于欧亚谱系A/DK/HK/Y280/97-like分支亚系,证明当前我国大部分地区的H9N2亚型禽流感病毒在同源疫苗的免疫选择压力下,其HA基因与现有疫苗株相比已发生了较大的遗传漂变.     

4株NDV分离株F基因的克隆与序列分析

对4 株具有一定代表性的NDV(新城疫病毒)分离株的F基因进行RT PCR(反转录聚合酶链反应)扩增和序列分析,根据基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中1 株属于弱毒株,3 株属于强毒株;核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明,3株强毒株与Clone30 基因核苷酸序列的同源性在83.6%~84.0%之间,与F48 E9典型NDV强毒株同源性在86.5.6%~88.3%之间,推导的氨基酸序列同源性与Clone 30 株在85.9%~87.0%之间,与F48E9典型NDV强毒株在89.1%~91.3%之间;利用MegAlign软件绘制了NDV 的系统发育进化树,结果表明, 3株分离强毒株为Ⅶ基因型,弱毒株为基因Ⅱ型。