鸡新城疫病毒分离株F基因的序列分析与基因分型研究

采用RT-PCR技术对2008～2009年间从我国部分省市分离的9株新城疫病毒的F基因进行扩增和测序,并进行了遗传进化和基因分型研究。结果表明,9株分离株的F基因的开放性阅读框架(ORF)长度均为1662bp,其中8株的F基因裂解位点属于强毒株模式,1株为弱毒株模式;分子进化和基因分型研究表明,8株强毒株均属于基因Ⅶ型d亚型,1株弱毒株为基因Ⅱ型。提示近年来流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型强毒株引起的,从而为强毒力新城疫的防控提供科学依据。     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

黑龙江部分地区野鸟源新城疫病毒HN、P基因的克隆和序列分析

为了解野鸟源新城疫病毒(NDV)基因变异情况,我们对14株2005年～2006年分离自黑龙江三江自然保护区和哈尔滨周边地区健康野鸟体内的NDV的HN和P基因分别进行RT-PCR扩增,并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定。结果显示:14株野鸟源NDVHN基因开放性阅读框架(ORF)均为1716bp,编码571个氨基酸;P基因开放阅读框均为1188bp,编码395个氨基酸。13株野鸟源NDVHN和P基因核苷酸同源性分别为96.4%～99.8%和95.8%～100%,分别与参考毒株HN和P基因相比,同源性为82.3%～98.7%和78.5%～99.4%。1株野鸟源NDV与参考毒株Mutkeswar的HN和P基因高度同源。分析表明:这14株NDV病毒与我国普遍流行的基因Ⅶ型和基因Ⅲ型NDV具有很高的同源性,提示野鸟与家禽新城疫的发生在流行病学和生态学上有着非常密切的关系。     

2株新城疫病毒广西分离株HN基因的克隆与序列分析

用设计的特异性引物,通过RT-PCR法对2013年间分离自广西的具有一定代表性的2株鸡新城疫病毒(GX-79-13-Ch,GX-117-13-Ch)进行HN基因的扩增和克隆,并对其进行核苷酸序列测定和分析。2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为1 716 bp,二者之间的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸同源性为99.0%。2个分离株HN基因核苷酸序列与国内外报道的相关序列同源性为81.2%~97.5%,推导氨基酸序列同源性为88.2%~97.6%。由系统发育树可见,与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有较高的同源性,表明2个分离株与现今流行于国内的Ⅶ型病毒株有密切联系。     

12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株做遗传进化分析。12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型。F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6%~91.5%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8%~99%之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9%~91.9%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84%~98.5%之间。氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控。     

影响新城疫病毒抗原性和分子变异的因素分析

<正>1新城疫病毒的变异选择与免疫原性密切相关的新城疫病毒(NDV)HN基因,对不同基因型(F基因型为Ⅰ～Ⅶ)的NDV参考株在HN基因ORF编码区内,进行了同义替代(Ks)和非同义替代(Ka)的比较,重点对11株国内流行的NDV强毒株(F基因型为Ⅶd)     

一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析

为分析从某鹅病料样品中分离鉴定的一株新城疫病毒(NDV) (Goose/Foshan/2010)F和HN基因的序列特征,本研究采用RT-PCR方法扩增该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定.经序列比对、进化分析表明,Goose/Foshan/2010株属于基因Ⅶb亚型病毒株,F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117,-HN蛋白由571个氨基酸残基组成,具有强毒株分子特征.对F和HN蛋白分析表明,其HN蛋白存在E347D和K495E两个点突变;此外,HN蛋白缺失了538位～540位的糖基化位点.该分离株为我国首次报道的鹅源基因Ⅶb亚型NDV分离株,与秘鲁及马来西亚早期基因Ⅶb亚型分离株进化关系密切,表明我国目前新城疫的流行情况十分复杂.     

3株新城疫山东分离株HN基因全序列测定和分析

用设计的特异性引物,通过RT-PCR法对1999和2004年间分离自山东省的具有一定代表性的3株鸡新城疫病毒(ShD-2-04,ShD-3-99,ShD-5-04)进行HN基因的扩增和克隆,并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明:3个毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为1716bp,编码571个氨基酸,属强毒的C群;3株山东分离毒的核苷酸同源性为98.2%~98.8%,氨基酸同源性为98.4%~98.8%,其中ShD-2-04和ShD-5-04核苷酸及氨基酸同源性均为最高,达到99.8%和99.8%;将3株山东分离毒株与国内外标准强毒株及弱毒株的HN基因核苷酸及氨基酸同源性分别进行比较:3毒株与国内外标准毒株HN的核苷酸同源性为82.7%~87.2%,氨基酸同源性为87.6%~90.0%,表明已发生一定的变异。     

鹅源新城疫病毒F基因和HN基因的克隆及序列分析

为了解近年鹅群中新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的流行变异情况,试验于2018年从广东地区疑似患有新城疫病死鹅的病料中分离到1株NDV,对其进行了生物学毒力测定及致病性研究,并利用RT-PCR技术扩增该分离株F基因和HN基因全长片段,进行克隆与序列分析。结果表明:分离株GD299的生物学毒力指标鸡胚平均致死时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致死指数(ICPI)和6周龄静脉接种指数(IVPI)分别为58 h、1.56和2.2,F基因裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,GD299株为强毒株;F基因和HN基因核苷酸序列和氨基酸序列与参考毒株的同源性为82.9%～99.5%,属于基因群Ⅶ型,其中F基因属于Ⅶf亚型;与经典强毒株La Sota株、F48E9株氨基酸序列进行比较,F基因氨基酸序列出现多处位点变异。说明目前流行的NDV已发生一定变异。     

2006～2008年华东地区新城疫病毒HN基因序列分析

为研究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的HN（血凝素-神经氨酸酶,hemagglutinin—neuraminidase）基因分子流行病学规律,利用RT—PCR扩增了2006～2008年间分离自我国华东地区的43株NDV的HN基因片段。基因序列分析显示,分离株中基因Ⅰ型2株,基因Ⅱ型3株,基因Ⅵ型1株,其它37株都属于基因Ⅶd亚型。根据遗传发生进化树可将基因Ⅶd亚型进一步分为Ⅶd1和Ⅶd2两个亚型,基因Ⅶd1亚型HN蛋白的第102、118、443位氨基酸分别为T,A和T,而基因Ⅶd2亚型则分别为I,E和M。另外,研究表明HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势。     

野禽新城疫病毒F和HN基因的遗传变异趋势

野禽携带的新城疫病毒是新城疫流行传播的重要的潜在传染源.结合本实验室克隆测序的鸽NDV(PB9601)、企鹅NDV(QE01)以及GenBank下载的44株野禽(包括野鸭、鹦鹉、鸽子、天鹅、鸳鸯、雁、火鸡等)的NDV毒株的融合蛋白(Fusion gene,F)基因和血凝素蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase gene,HN)基因分别进行了F蛋白裂解位点、基因分型以及F和HN基因氨基酸全长的遗传距离分析.结果表明:野禽感染NDV F基因的基因型以Ⅶ和Ⅵ为主,同时I、II、V和IX多种基因型并存.同一种属、同一地区的毒株间的遗传距离较近,具有明显的种属性和区域性,且绝大多数分离株与经典毒株LaSota、V4、B1、TEX-48等的遗传距离相对较远;对HN基因的遗传进化关系分析得出了相似的结论.     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

几株鸡新城疫病毒的分离鉴定及其基因型分析

从几个发生禽病的地区分离到6株病毒,经过血凝试验、血凝抑制试验、中和试验、分子生物学试验等确定为鸡新城疫病毒;根据GenBank公布的新城疫F基因强弱毒株相关基因序列设计合成1对特异性引物,扩增出的F基因片段长度约为610 bp,测序后进行序列比对,并分析其核苷酸序列和氨基酸序列,结果显示,有3株具有新城疫强毒株特性,同时还具备新城疫Ⅶ基因型特征,另外根据平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉致病指数(IVPI)指标测定结果,最终判定这3株是新城疫强毒株且属于基因Ⅶ型,其余3株病毒分离株与La Sota的核酸序列同源性与氨基酸序列同源性均为99%。     

产蛋下降鸭群强毒新城疫病毒的分离鉴定与分子特征

从产蛋下降鸭群分离到两株新城疫病毒(NDV)(命名为Duck/China/SD6/2008和Duck/China/SD7/2009),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间为77.6h,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征。根据F基因(374bp)对2个NDV分离株和30个NDV参考株进行基因分型结果表明,2个分离株均属于基因Ⅶ型。F基因和HN基因核苷酸序列同源性比较显示,2个鸭分离株与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为94.1%～99.7%和94.4%～97.1%,与同期分离的鸡源NDV强毒株Chicken/China/SD4/2008同源性最高,分别为99.3%～99.5%和99.5%～99.7%,表明这两个鸭NDV毒株可能来源于感染NDV的鸡群。     

鹅源禽副粘病毒NA-1株HN蛋白基因的遗传变异研究

鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。     

新城疫病毒贵州不同鸡源分离株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术扩增NDV贵州不同鸡源分离株,包括肉鸡源P1株与BY株、蛋鸡源H2株与FW株、七彩山鸡源N98株和越南斗鸡源DQ株的F蛋白基因,将该基因片段分别进行克隆和测序,并与国内外NDV参考株的对应序列进行比较分析。结果表明:6株NDV贵州不同鸡源分离株的F基因长度均为1 662 bp,编码553个氨基酸;分离株间核苷酸同源性为86.9%~99.7%,氨基酸同源性为91.0%~99.3%;与国内外NDV代表株(LaSota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW 2000株)的核苷酸同源性为84.0%~98.9%,氨基酸同源性为87.2%~98.6%;经系统发育进化树分析,DQ株、N98株、P1株和H2株为基因VIId型,而BY株和FW株为基因IX型。这些结果提示贵州省不同鸡群间存在相同NDV毒株感染的可能性,不同年份间NDV毒株发生基因型改变,而近年来贵州省流行的ND疫情主要是由NDV基因VII型引起。     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。