一株基因Ⅶb亚型新城疫病毒F和HN基因的序列分析

为分析从某鹅病料样品中分离鉴定的一株新城疫病毒(NDV) (Goose/Foshan/2010)F和HN基因的序列特征,本研究采用RT-PCR方法扩增该病毒的F和HN基因的ORF序列,并进行序列测定.经序列比对、进化分析表明,Goose/Foshan/2010株属于基因Ⅶb亚型病毒株,F蛋白裂解位点序列为112RRQKRF117,-HN蛋白由571个氨基酸残基组成,具有强毒株分子特征.对F和HN蛋白分析表明,其HN蛋白存在E347D和K495E两个点突变;此外,HN蛋白缺失了538位～540位的糖基化位点.该分离株为我国首次报道的鹅源基因Ⅶb亚型NDV分离株,与秘鲁及马来西亚早期基因Ⅶb亚型分离株进化关系密切,表明我国目前新城疫的流行情况十分复杂.     

鸭新城疫病毒山东分离株的生物学特性与F基因遗传进化分析

从山东规模化鸭场采集棉拭子样品并接种SPF鸡胚分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致死指数(ICPI)来确定分离株的毒力,采用RT-PCR方法对分离株F基因进行测序并进行遗传进化分析。结果显示,从正常鸭群棉拭子中分离到4株NDV,F蛋白裂解位点的氨基酸序列表明4个分离株中2株氨基酸序列为112 ERQERL117,1株为112 GKQGRL117,符合弱毒株序列特征;1个分离株为112 RRQKRL117,符合强毒株序列特征。系统进化分析表明,其中2株属于ClassⅠ分支、2株属于ClassⅡ分支,ClassⅡ分支中的2个分离株1个为基因Ⅶ型强毒株,1个属于基因Ⅰ型弱毒株,与Queensland V4等毒株的同源性较高。     

广东地区8株鹅源基因Ⅻ型新城疫病毒F蛋白基因遗传进化分析

为了解当前广东地区鹅群新城疫病毒(NDV)遗传进化情况,本研究从广东养殖病死鹅组织样品中分离鉴定获得8株NDV,对分离株的F蛋白基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。8株分离病毒之间F蛋白基因同源性较高,为96.3%-99.9%,但与当前国内NDV优势流行株及疫苗株同源性均较低。遗传进化分析结果显示所有新分离株均属于Ⅻ型NDVⅫb亚型分支,而当前国内NDV的优势流行株及常用疫苗株均属于Ⅶd亚型分支。氨基酸序列分析结果显示,本研究分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为~(112)K/RRQKR/F~(117),符合强毒株分子特征;与基因Ⅶ型代表株NDV/ZJ1相比,新分离株F蛋白B细胞中和抗原表位均出现D~(170)N变异;而与2010年～2011年报道的广东Ⅻb亚型分离株相比,新分离株F蛋白疏水区、七肽重复序列等区域均出现氨基酸的变异。综上所述,本研究分离鉴定的8株鹅源NDV的F基因均属于Ⅻb亚型,与Ⅶd亚型流行株及常用疫苗株F基因同源性较低,且其多个氨基酸关键位点存在变异。本研究在国内首次从病死鹅体内分离到基因Ⅻ型NDV,为进一步了解基因Ⅻ型NDV在广东地区水禽中的流行、病原进化以及疫苗株更新提供参考。     

从种蛋中分离的新城疫病毒抗原性及其F和HN基因的分析

对3株首次从种蛋中分离到的NDV进行交叉HI试验表明,这3株分离毒的交叉HI同源性为98.1%～100%。对这3株病毒及另1株从输卵管分离到的NDV的F与HN完整基因进行扩增并克隆测序,序列结果登陆GenBank(FJ011441～FJ011448)。氨基酸同源性分析表明:这4个毒株的F与HN基因同源性分别为99.5%～99.8%和99.6%～100%,远高于其与Lasota、F48E8株以及目前国内流行的其他基因Ⅶ型毒株的同源性。分离株F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特征,根据绘制的遗传进化树分析,属于基因Ⅶ型。研究结果显示这4个不同来源毒株其2个基因的同步高度同源性可能与它们均是与生殖道感染有关。     

一株野鸭源基因Ⅲ型新城疫病毒主要生物学特性及基因组序列测定分析

为研究分离自黑龙江三江自然保护区的野生绿头鸭粪拭子中的一株新城疫病毒(命名为Mallard/CH/HLJ383/06)主要生物学特性及基因组序列,本实验对病毒F基因序列进行测定,结果表明该病毒分离株属于NDV基因Ⅲ型,病毒的1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)为1.81,高于NDV中等毒力病毒株ICPI值,预示该病毒分离株毒力有增强趋势.15日龄SPF鸡致病性试验表明,该病毒分离株可导致雏鸡发病但不死亡,致病性仍低于与其ICPI值相近的基因Ⅶ型毒株.对该病毒分离株进行全基因组序列分析表明:该病毒分离株与Ⅰ系疫苗病毒Mukteswar、江苏2株基因Ⅲ型分离株(JS/7/05/Ch,JS/9/05/Go)结构蛋白氨基酸同源性高达99.0%～99.7%;与疫苗株Mukteswar相比,3株基因Ⅲ型病毒分离株在F蛋白中只有1个共同的氨基酸位点变异(A203T);HN蛋白中存在15个变异氨基酸,但位置各不相同;L蛋白中变异位点最多,为28个,其中有4个变异位点为3个分离株所共有.以上结果初步表明,Mallard/CH/HLJ383/06株可能是由疫苗株Mukteswar在野禽、家禽生态系统中传播进化而来,并由于宿主或免疫压力而发生毒力变异;分离株L蛋白氨基酸位点的变异,可能是导致病毒株毒力返强主要因素之一.     

4株NDV分离株F基因的克隆与序列分析

对4 株具有一定代表性的NDV(新城疫病毒)分离株的F基因进行RT PCR(反转录聚合酶链反应)扩增和序列分析,根据基因裂解位点的氨基酸序列推测,其中1 株属于弱毒株,3 株属于强毒株;核苷酸序列及其推导的氨基酸序列比较结果表明,3株强毒株与Clone30 基因核苷酸序列的同源性在83.6%~84.0%之间,与F48 E9典型NDV强毒株同源性在86.5.6%~88.3%之间,推导的氨基酸序列同源性与Clone 30 株在85.9%~87.0%之间,与F48E9典型NDV强毒株在89.1%~91.3%之间;利用MegAlign软件绘制了NDV 的系统发育进化树,结果表明, 3株分离强毒株为Ⅶ基因型,弱毒株为基因Ⅱ型。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

鸭源新城疫病毒SS1株全基因序列测定及遗传进化分析

对从贵州省某三穗鸭养殖场病死鸭体内分离的1株新城疫病毒(NDV)Sheldrakeduck/China/Guizhou/SS1/2014(简称SS1株)进行部分生物学特性测定及全基因测序与分析。结果表明:SS1株的MDT、ICPI和IVPI分别为52 h、1.89和2.80,F基因编码蛋白的裂解位点序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),HN基因编码571个氨基酸,均符合NDV强毒株特征;SS1株基因组全长为15 192 bp,各基因片段核苷酸序列与代表性基因Ⅶ型毒株ZJ1、NA-1、SF02和FP1/02相似性最高,达96.3%~98.7%,而与疫苗株V4、La Sota和Mukteswar同源性最低,为82.8%~85.4%;根据F基因序列绘制的系统进化树显示SS1株属于ClassⅡ基因Ⅶd亚型。F和HN蛋白氨基酸序列分析发现,SS1株F蛋白中和抗原位点第170位氨基酸、HN蛋白抗原区及其邻近氨基酸位点与国内当前流行的基因Ⅶd亚型NDV毒株一致,而与疫苗株有较大的差异。此外,交叉血凝抑制试验结果表明,SS1株与传统疫苗株La Sota的抗原同源性为84.5%,而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性为100%,表明分离株与疫苗株存在一定的抗原差异。     

某规模场产蛋量下降鸡群新城疫病毒分离与鉴定

对某规模场鸡群采集的23份鸡咽喉或泄殖腔棉拭子进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测,证实分离出17株新城疫病毒(NDV)。对F、HN基因经RT-PCR扩增、克隆并对其进行测序,选取具有代表性的4个毒株进行序列比对及遗传演化分析。系统发育分析结果表明,4株病毒均属于基因Ⅶe型,F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具备NDV强毒株裂解位点氨基酸排列特征。其F基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于96.1%~96.7%、97.3%~98.0%;与P1株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于95.0%~95.4%、96.2%~96.7%,其HN基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于96.2%~96.5%、95.3%~95.9%;与SN-5-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于94.9%~95.3%、96.4%~96.8%。血清学交叉试验显示,NDV分离毒株为抗原测得的同批血清样品抗体效价存在显著差异。近年流行的新城疫疫情主要由基因Ⅶ型NDV引起的,该规模场产蛋量下降可能与F和HN基因的变异有关。     

2008-2009年部分地区新城疫病毒分离株的进化分析

本研究旨在从分子水平上掌握中国新城疫病毒的变异情况和新城疫的流行规律,对2008-2009年从中国部分省市养殖场分离的9株新城疫病毒毒株,采用RT-PCR方法扩增其F和HN基因,经克隆和测序,对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,9株分离株有8株为基因Ⅶ型,1株为基因Ⅱ型,F基因开放性阅读框架(ORF)为1662 bp,强毒株同La Sota的核苷酸同源性为83.5%~84.2%。HN基因开放性阅读框架(ORF)为1716或1734 bp,强毒株在538位缺失1个糖基化位点。结果表明,近年流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型NDV引起,F和HN基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征

从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒(命名为SHY06),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52 h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征.根据F基因(1-374 bp)对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型结果表明SHY06属于基因Ⅶ型.F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因Ⅸ型NDV(F48E9等)同源性为91.7%～92.4%,与基因Ⅱ型(疫苗株LaSota等)同源性为89.2%. HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株(LaSota)和标准强毒株(F48E9)同源性较低,分别为87.6%和89.9%.     

秦岭北麓关中地区野鸟源基因Ⅸ型新城疫病毒病原学监测及分离株毒力测定

为评价秦岭北麓关中地区野鸟源基因Ⅸ型斯城疫病毒(NDV)流行及毒力情况,对374份源于该区域健康野鸟的咽喉、泄殖腔拭子进行病毒分离与鉴定,并对NDV分离株进行生物学特征和遗传进化分析.结果共分离到5株野鸟源NDV(包括2株候鸟源),其致病指数MDT、ICPI、IVPI差异较大,分别为37.2～64.8 h,0.425～1.638,2.04～2.76.F基因(535 bp)推导氨基酸序列和同源性分析显示,5株NDV分离毒均具有强毒的融合(F)蛋白裂解位点112R-R-Q-R-R-F117,5株分离毒间同源性高达99.8％～100.0％.F基因高变区(42～420 nt,374 bp)分析显示5株分离毒均属于我国特有的基因Ⅸ型NDV,与我国早期的基因Ⅸ型NDV流行株F48E9亲缘关系很近(核苷酸同源性为99.4％～99.6％),而与La Sota和V4等传统疫苗株及目前家禽中流行基因Ⅶ型NDV毒株亲缘关系较远.本研究表明,健康野鸟为基因ⅨNDV的携带者,尽管首次获得的5株野鸟源基因Ⅸ型NDV毒株生物学特征差异较大,但均具有强毒的分子生物学特征及致病性,提示对周边环境和家禽养殖业存在潜在威胁.     

新城疫流行株GX-08全基因序列分析及其对鸭的致病性研究

2008年从患病免疫鸡群中分离到1株新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）流行株,经致病指数测定为强毒株,编号为GX-08。致病性试验表明,GX-08株对鸭具有感染性和致病性。参照GenBank发表的NDV基因序列设计10对特异性引物,采用RT-PCR方法对GX-08株全基因组序列分段进行扩增。拼接后序列分析表明GX-08株的全基因组序列总长为15192 nt,包含6个开放阅读框,分别编码6种蛋白质NP、P、M、F、HN和L。F基因裂解位点处的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列特点。F基因第47—420位片段基因分型分析结果表明,该流行株属于基因Ⅶ型。     

辽宁省新城疫病毒F基因和HN基因的分子特征与致病性

采用RT-PCR对新城疫病毒辽宁分离株的F基因和HN基因进行扩增并测序,初步研究其分子特性分析和致病性。结果表明,分离株CY1株、DD2株、YK1株和TL4株的致死鸡胚平均时间(MDT)分别为50.6 h、76.3 h、62.9 h和81.3 h,CY1株具有强毒特征。F基因分型显示,CY1株属于Ⅶ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112RRQKRF117,符合NDV强毒氨基酸基序特征,与流行株js02株的亲缘关系非常近,与疫苗株LaSota、Queensland V4亲缘关系均较远。DD2株、YK1株和TL4株均属于基因Ⅱ型,其F蛋白多肽裂解位点的序列为112GRQGRL117,符合NDV非强毒氨基酸基序特征,与LaSota株亲缘关系最近。本研究将为本省新城疫防制对策的制定提供参考。     

1株广东鸡源新城疫病毒的分离鉴定和毒力基因分析

从广东粤东地区某商品蛋鸡场的发病鸡群中分离到1株病毒（YS株）,经血凝和血凝抑制试验确定为新城疫病毒（NDV）.对该分离株的F蛋白氨基酸序列的分析结果表明,其F0裂解位点的氨基酸序列为1nR-R-Q-K-R-F117,且含有101K和121V,符合典型NDV强毒株的分子特点.遗传分析结果显示分离株属于基因Ⅶd亚型.F和HN基因的氨基酸相似性分析表明,分离株与基因Ⅶ型NDV Chicken/China/Shandong/02/2010株的相似性最高,均达到99％,而与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和La Sota的相似性则较低,分别在86.8％～ 90.4％和87.2％～88.3％之间,说明分离株与经典的NDV毒株存在一定的差异.     

12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株做遗传进化分析。12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型。F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6%~91.5%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8%~99%之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9%~91.9%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84%~98.5%之间。氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控。     

一株新城疫病毒的分离鉴定及其F基因的克隆与序列分析

本试验对山东某鸡场发生疑似新城疫感染的肉鸡分离得到的一株病毒,经鸡红细胞血凝、血抑试验和动物回归试验,结果表明,该分离株为新城疫病毒。对其毒力学指标进行测定,结果MDT为55.6h,ICPI为1.95,IVPI为2.85,表明该毒株为新城疫强毒株。PCR特异性扩增NDV-SD-02的F基因,大小为1662bp,编码553个氨基酸,F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株氨基酸序列的特点,与生物学特性测定的结果完全相符。对分离株F基因的序列分析表明,与近年来国内外分离得到的Ⅶ型NDV同源性较高,为84.7%~98.9%,该毒株属基因Ⅶ型。     

5株鸡源新城疫病毒F基因特性分析

为调查山西省鸡源新城疫病毒(NDV)的流行现状,2012—2013年从山西省部分地区的发病鸡群分离、鉴定出5株NDV,并对这5株NDV的分子生物学特性进行了研究。对各分离株F基因序列的分析表明:其中的4株病毒在基因型分类上属于基因Ⅱ亚型,并与标准弱毒疫苗La Sota株高度同源,为99.2%⁹9.4%。氨基酸序列同源性为100%,且裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,符合弱毒株裂解位点特征。另一分离毒株在基因型分类上与JS/5/01/Go同属基因Ⅶd亚型,两者基因序列同源性为95.6%,氨基酸序列同源性为97.5%。其裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,为强毒株裂解位点特征。     

一株蛋鸡新城疫病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究云南新城疫病毒(NDV)分子流行特性和致病性,对云南省1个蛋鸡场的组织样品进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测分离毒株,证明为NDV。通过病毒最小致死量(MLD)、鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡胚平均死亡时间(MDT)、脑内接种致病指数(ICPI)和静脉接种致病指数(IVPI)测定病毒毒力,结果EID_(50)为10~(-4.4),MLD为10~(-4),MDT为97.5 h,ICPI为0,IVPI为0,显示分离株为弱毒株。高通量测序及遗传进化分析发现,分离毒株基因组全长为15 198 bp,从3′端到5′端有6个结构基因依次为NP-P-M-F-HN-L,各基因之间有1～48个核苷酸间隔。全基因组、F和HN基因遗传进化分析证明分离毒株属于ClassⅠ分支,F基因ORF全长为1 662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-ERQERL-117,符合NDV弱毒裂解位点特征,HN基因ORF全长为1 851 bp,编码616个氨基酸,在HN基因保守区域234-NRKSCS-239位氨基酸序列没有发生变异。F蛋白有6个糖基化位点比较保守,HN蛋白有6个潜在的糖基化位点,但与LaSota相比存在缺失的和多出的糖基化位点。F蛋白半胱氨酸残基分布在76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523位氨基酸,F蛋白中性抗原位点在72、75、79和170位氨基酸发生了变异,HN蛋白受体结合部位和NA活性位点氨基酸为174R、401E、416R、526Y,未发生变异。本研究首次报道了云南省蛋鸡新城疫ClassⅠ毒株的全基因序列特征,为新城疫病毒ClassⅠ毒株研究奠定了基础。