牛瘤胃微生物定量测定方法研究进展

瘤胃微生物数量测定一直是反刍动物营养的难点之一.传统的定量方法有亨氏滚管法和最大可能计数法(MPN)两种,方法简单,但工作量大,测定结果与实际存在偏差.现代分子定量技术的出现和发展,为瘤胃微生物数量的测定提供了一种新的思路和方法.如核算分子杂交技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)、定量PCR...     

瘤胃微生物的传统定量方法在反刍动物中的应用

瘤胃微生物作为一个完整的生态系统,受日粮成分、饲养方式、季节等诸多因素的影响,认识瘤胃微生物的功能及其活动规律复杂而困难。瘤胃微生物的传统定量方法有亨氏滚管法和最大或然数计数法,二者有着各自的优缺点。本文综述了瘤胃微生物的传统定量方法的应用状况及各自的优缺点。     

基于16S/18S rRNA/rDNA的分子技术在定量瘤胃微生物中的研究进展

瘤胃微生物是反刍动物与日粮间的纽带。用传统或经典的亨氏滚管法和最大似然法测定瘤胃内微生物总数的结果可能偏低。采用培养方法培养的已知菌种可能不完全适合或进入了未培养状态。由于缺少可行的方法,未知菌种从未培养过。由于任何一个细胞都含核糖体,rRNA/rDNA有进化守恒的特性,建立在16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下,不仅能用于描述分子特性,而且能检测数量和提供用于预测自然进化关系的分类方法。基于不同的16S/18S rRNA/rDNA的守恒区能设计出通用、属、种甚至株特异性探针或引物,通过分子杂交能检测、量化细胞含量和测定细胞活性。杂交可得到某个序列或微生物的相对或绝对量。然而,杂交的灵敏度较低,它仅能检测出超过106个细菌/m l瘤胃液。竞争PCR和实时PCR已开发并用于检测瘤胃微生物,其灵敏度达到检测单个细菌。16S/18S rRNA/rDNA方法已成功用于瘤胃环境研究而且很快获得认可。但是基于16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术不能排斥经典传统微生物方法,但它将成为一项便利技术用于瘤胃微生物研究。     

传统技术与现代分子生物学技术在瘤胃微生物多样性方面的研究进展

为了提高反刍动物利用瘤胃微生物的效率,微生物学家和动物营养学家都致力于瘤胃微生物的培养分离纯化和生理生化特性研究.但是由于瘤胃微生物大多是厌氧性的,很难培养成功,传统技术在瘤胃微生物的研究上受到很多限制.随着科学技术的进步,现代分子技术也开始逐渐渗透到瘤胃微生物的研究中来.文章将瘤胃微生物多样性研究的方法简要划分为纯培养技术,现代分子生物学技术和上述两种方法的联合使用,并重点阐述了不同方法的优缺点,展望了瘤胃微生物多样性研究方法的发展前景.     

瘤胃微生物定量方法的研究进展

当前人们对瘤胃中微生物的认识只有10%～20%,不断改进研究技术和手段,才能大大推动瘤胃微生态领域的研究。作者阐述了瘤胃微生物传统定量方法（滚管计数法和最大或然数法）和分子生物学定量方法,如探针杂交技术、荧光原位杂交、DGGE、定量PCR和流式细胞计量术（flow cytometry )等的应用状况及其各自的优缺点。     

2008-2009年反刍动物营养研究进展 Ⅰ.瘤胃微生物多样性与功能

作者综述了2008-2009年间在ADSA-ASAS年会和CNKI、PubMed等数据库中与瘤胃微生物分子多态性和元基因组学相关的42篇文献。在瘤胃微生物多样性方面,研究方法不断优化及研究者将研究对象扩大到小品种反刍动物瘤胃微生物,不仅大大丰富了瘤胃微生物多样性数据库,而且表明瘤胃微生物群落组成受到宿主遗传背景、生长发育阶段和健康状态的影响,并且随日粮、季节等环境条件的变化呈现动态变化的特点。在瘤胃微生物的功能方面,主要围绕瘤胃中复杂碳水化合物降解、甲烷代谢及不饱和脂肪酸氢化3个主题,从微生物生理学、基因组学和元基因组学的角度阐述了2009年度的主要进展。尽管瘤胃微生物多样性和功能的相关研究积累了大量研究数据,但瘤胃微生物群落中影响宿主代谢和生产性能的关键功能菌的鉴定、分离、作用模式及其利用等问题仍然悬而未决。综合利用分子生态学、元基因组学和代谢组学等方法,研究瘤胃微生物群落与反刍动物的交互作用,可能成为揭示瘤胃微生物群落与反刍动物生产性能的关系、充分利用瘤胃微生物群落资源的新突破口。     

中国农业科学院畜牧研究所：反刍动物营养研究室简介

反刍动物营养研究室成立于1993年，建立了分子生物学实验室、瘤胃微生物实验室、细胞培养实验室、生理生化实验室、畜产品品质和饲料营养价值评定实验室。“十五”期间研究建立了瘤胃微生物定量法，实现了目标瘤胃微生物定量调控；建立了牛奶中微量脂肪酸（CLA）批量检测方法，研发了提高牛奶天然CLA含量的成套技术。     

瘤胃微生物宏组学分析及研究进展

瘤胃微生物在反刍动物饲粮消化和吸收中起着重要的作用,深入探索瘤胃微生物群落结构、代谢活动和功能作用,对反刍动物健康和促进饲草利用效率具有重要意义。相对传统瘤胃微生物纯培养方法,组学技术能够更加全面对瘤胃微生物种类、代谢途径、功能进行解释,宏组学联用为系统理解瘤胃微生物降解纤维物质分子机理提供新方式,并受到研究人员越来越多的关注。本文总结了宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学与代谢组学在瘤胃微生物研究中的应用,并围绕宏组学技术联合应用进行综述,为反刍动物瘤胃微生物的研究提供理论支持。     

实时定量PCR技术在瘤胃微生物定量分析中的研究应用

随着对瘤胃微生物研究的逐步深入,一些以分子生物学技术为基础的定量分析方法对瘤胃微生物的研究方兴未艾。本文简要介绍了实时定量PCR技术的原理、操作程序以及该技术在反刍动物瘤胃微生物定量分析中的应用现状、取得的成果和前景展望。     

瘤胃微生物移植在反刍动物生产中的应用及作用机制

反刍动物消化道菌群对其生长发育起着至关重要的作用，高效稳定的瘤胃微生物区系可保障宿主机体的营养物质消化率、免疫功能等。人们对反刍动物瘤胃微生物调控做了大量研究。瘤胃微生物移植作为瘤胃微生物调控手段之一，是将健康动物的瘤胃微生物及其代谢物移植至受体动物，以达到提高受体动物生产性能和健康状况等目的。本文从瘤胃微生物移植的方式和应用效果及目前发展状况出发，综述了瘤胃微生物移植对反刍动物生长发育和生产性能的影响，并分析了其可能的作用机制和影响因素，旨在为进一步研究提供理论依据。     

瘤胃微生物生态研究方法评述

瘤胃微生物生态研究方法主要经历了微生物纯培养、混合培养、微生物分子生物学技术[(从瘤胃中提取DNA,进行PCR-16S rDNA(rRNA)技术]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术),在不同程度上揭示了瘤胃微生物群落丰富的多样性和生态功能.但由于各种方法本身的局限性,限制了人类对瘤胃微生物的全面了解,现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为瘤胃微生物生态研究提供较好的前景.     

牦牛瘤胃微生物研究进展

反刍动物瘤胃是消化过程中的重要器官,它可以分解植物的纤维供宿主利用,而牦牛相较于其他反刍动物而言,有更高的纤维利用率。到目前为止,人们利用分子生物技术对瘤胃微生物进行鉴别分析,已经有大量微生物的功能被发现,但绝大部分微生物的功能还未被确定。瘤胃微生物作为巨大的潜在资源,如果可以在牦牛瘤胃内调节甚至在不同家畜瘤胃内移植,将会推动我国畜牧行业的进步。为此,文章介绍了牦牛瘤胃微生物的种类及功能,并对瘤胃微生物的影响因素进行了详细阐述,以期为相关研究提供一定参考。     

2007~2008年国际反刍动物营养研究进展 Ⅰ.瘤胃微生物多样性和功能

随着试验生物学和生物信息学的快速发展,对瘤胃微生物的多样性和功能开展了系统的研究。笔者综述了2007～2008年在CNKI、ADSA ASAS大会和PubMed等数据库中与瘤胃微生物分子多态性和元基因组学相关的32篇文献。瘤胃微生物群落在“属”分类水平上多样性水平较低,在亚种或菌株水平上表现出极大的多样性,多样性指数估计表明,瘤胃内细菌种类约为900多种,而菌株类型（独特序列型）约为97000种。瘤胃微生物群落结构受到宿主遗传背景、生长发育阶段、日粮、环境条件等多种因素的影响。瘤胃微生物组中蕴藏了大量具有应用潜力的遗传资源,这些结果为准确了解瘤胃微生物群落结构、功能及其调控方式提供了重要的基础。     

鹌鹑肠道微生物总DNA的最佳提取方法

为了获取高质量、较完整的肠道菌群基因组DNA,试验采用常规的饱和苯酚/氯仿法(方法一)、牛瘤胃DNA的提取法(方法二)和对上述两种方法进行优化后得到的肠道微生物DNA的提取法(方法三)对鹌鹑肠道微生物总DNA进行了提取,并对结果进行了比较。结果表明:应用方法一和方法二提取的DNA浓度比较低,电泳显示样品DNA条带没有方法三明亮;以方法三提取的肠道总DNA为模板,采用细菌通用引物,对其16S rDNA V3可变区进行PCR扩增,得到较清晰的图谱,条带整齐。说明采用方法三提取鹌鹑肠道微生物DNA较完整,可用于后续的分子生物学试验研究。     

粗饲料营养价值指数及评定方法

粗饲料是反刍动物瘤胃微生物和宿主主要的营养来源,科学有效地评价粗饲料营养和饲喂价值,对于开发饲料资源、合理利用粗饲料和提高其利用效率至关重要。本文简述了国内外对动物粗饲料营养价值的评定指数和方法,介绍了粗饲料营养价值评定方法的发展以及各方法的优缺点,指出实际研究中可根据不同的科研需求,选择适合的评定指数和方法,根据实际情况完善评定指数和评定方法,对粗饲料营养价值的科学评定和合理利用起到一定借鉴作用。     

Research note: effect of increasing dietary concentrate levels on microbial biotin metabolism in the artificial rumen simulation system (RUSITEC).

The effect of varying hay/barley-proportions in the feed ration on biotin metabolism of rumen microbes was studied by means of the rumen simulation technique RUSITEC. The stepwise replacement of hay by barley decreased dietary biotin and the net output of biotin by the microbial metabolism. It is concluded that rumen microbes utilise more and/or synthesize less biotin with increasing proportions of dietary barley. These results indicate that a critical reconsideration of current views with regard to the supply and requirement of the high yielding dairy cow for biotin is necessary.     

DGGE技术在瘤胃微生物多态性研究中的应用

利用传统的方法很难鉴别瘤胃微生物的差异,变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术就很好地解决了该问题。DGGE是一种新型的用于检测核酸变异和点突变的电泳方法,具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点,可应用于瘤胃微生物群落多样性和动态性分析。     

微生物总DNA的提取

目前,对微生物多样性的研究越来越多地从传统的培养方法转向分子生物学方法,现代分子生物学技术的蓬勃发展解决了不可培养微生物研究的难题,使肠道微生物的研究进入了一个新的发展阶段,而肠道微生物总DNA的提取是整个分子生物学方法的关键.主要总结了前人提取土壤、植物、粪便、瘤胃和肠道微生物DNA的试验方法,介绍了微生物总DNA的纯化方法,为用于分子生物学研究的肠道微生物总DNA的提取提供依据.