现代分子生物学技术在瘤胃产甲烷菌研究中的应用

瘤胃产甲烷菌代谢产生的甲烷气体,既能引起饲料能量的损失,又能引起温室效应,因此成为当前的一个研究热点.了解瘤胃产甲烷菌菌群的组成及其多样性是对其菌群结构进行调控,并最终控制甲烷产生的基础.但由于产甲烷菌培养条件要求苛刻,迄今为止只有少数几种产甲烷菌得到分离培养.现代分子生物学的迅速发展和应用,突破了瘤胃微生物不可培养的限制,极大地推动了对产甲烷菌的研究.本文综述了现代分子生物学技术在瘤胃产甲烷菌研究中的应用进展情况,并对其发展前景作了展望.     

瘤胃微生物生态研究方法评述

瘤胃微生物生态研究方法主要经历了微生物纯培养、混合培养、微生物分子生物学技术[(从瘤胃中提取DNA,进行PCR-16S rDNA(rRNA)技术]、变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术),在不同程度上揭示了瘤胃微生物群落丰富的多样性和生态功能.但由于各种方法本身的局限性,限制了人类对瘤胃微生物的全面了解,现代生物技术和传统微生物研究方法的配合将为瘤胃微生物生态研究提供较好的前景.     

16SrRNA指纹分析技术在瘤胃微生物研究中的应用

随着试验生物学和生物信息学的快速发展,对瘤胃微生物的多样性开展了系统的研究.利用传统的方法很难鉴别瘤胃微生物的差异,基于16SrRNA的指纹分析技术就很好地解决了该问题.该技术具有可靠性强和方便快捷等优点,可应用于瘤胃微生物群落多样性分析.     

微生物总DNA的提取

目前,对微生物多样性的研究越来越多地从传统的培养方法转向分子生物学方法,现代分子生物学技术的蓬勃发展解决了不可培养微生物研究的难题,使肠道微生物的研究进入了一个新的发展阶段,而肠道微生物总DNA的提取是整个分子生物学方法的关键.主要总结了前人提取土壤、植物、粪便、瘤胃和肠道微生物DNA的试验方法,介绍了微生物总DNA的纯化方法,为用于分子生物学研究的肠道微生物总DNA的提取提供依据.     

RNA-Seq技术在瘤胃微生物研究中的应用进展

反刍动物瘤胃内多种多样的微生物组成一个复杂的微生态系统,它们在瘤胃内物质消化过程中发挥重要作用。RNA-Seq技术的出现为反刍动物瘤胃微生物的研究提供了前所未有的机遇。本文主要从新一代高通量测序技术出发,阐述RNA-Seq技术在瘤胃微生物代谢酶特性、瘤胃微生物的多样性、瘤胃微生物新功能基因方面的应用,以期为瘤胃微生物的研究提供参考。     

分子生物学技术的引入对拓展瘤胃微生态研究的作用

为了充分发挥瘤胃的发酵功能,研究人员一直致力于瘤胃微生态的研究。随着分子生物学技术的发展,研究瘤胃微生态学采用人工培养为基础的传统方法正在被以核酸为基础的分子生物学技术迅速取代。分子生物学技术对瘤胃微生态的研究可从微生物多样性、区系结构、功能几方面进行概括。本文将从上述几方面论述分子生物学技术在瘤胃微生态研究中的应用及最新研究进展。     

基于16S/18S rRNA/rDNA的分子技术在定量瘤胃微生物中的研究进展

瘤胃微生物是反刍动物与日粮间的纽带。用传统或经典的亨氏滚管法和最大似然法测定瘤胃内微生物总数的结果可能偏低。采用培养方法培养的已知菌种可能不完全适合或进入了未培养状态。由于缺少可行的方法,未知菌种从未培养过。由于任何一个细胞都含核糖体,rRNA/rDNA有进化守恒的特性,建立在16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术在不需要培养微生物的条件下,不仅能用于描述分子特性,而且能检测数量和提供用于预测自然进化关系的分类方法。基于不同的16S/18S rRNA/rDNA的守恒区能设计出通用、属、种甚至株特异性探针或引物,通过分子杂交能检测、量化细胞含量和测定细胞活性。杂交可得到某个序列或微生物的相对或绝对量。然而,杂交的灵敏度较低,它仅能检测出超过106个细菌/m l瘤胃液。竞争PCR和实时PCR已开发并用于检测瘤胃微生物,其灵敏度达到检测单个细菌。16S/18S rRNA/rDNA方法已成功用于瘤胃环境研究而且很快获得认可。但是基于16S/18S rRNA/rDNA的现代分子技术不能排斥经典传统微生物方法,但它将成为一项便利技术用于瘤胃微生物研究。     

2008-2009年反刍动物营养研究进展 Ⅰ.瘤胃微生物多样性与功能

作者综述了2008-2009年间在ADSA-ASAS年会和CNKI、PubMed等数据库中与瘤胃微生物分子多态性和元基因组学相关的42篇文献。在瘤胃微生物多样性方面,研究方法不断优化及研究者将研究对象扩大到小品种反刍动物瘤胃微生物,不仅大大丰富了瘤胃微生物多样性数据库,而且表明瘤胃微生物群落组成受到宿主遗传背景、生长发育阶段和健康状态的影响,并且随日粮、季节等环境条件的变化呈现动态变化的特点。在瘤胃微生物的功能方面,主要围绕瘤胃中复杂碳水化合物降解、甲烷代谢及不饱和脂肪酸氢化3个主题,从微生物生理学、基因组学和元基因组学的角度阐述了2009年度的主要进展。尽管瘤胃微生物多样性和功能的相关研究积累了大量研究数据,但瘤胃微生物群落中影响宿主代谢和生产性能的关键功能菌的鉴定、分离、作用模式及其利用等问题仍然悬而未决。综合利用分子生态学、元基因组学和代谢组学等方法,研究瘤胃微生物群落与反刍动物的交互作用,可能成为揭示瘤胃微生物群落与反刍动物生产性能的关系、充分利用瘤胃微生物群落资源的新突破口。     

瘤胃微生物的多样性及其研究技术

瘤胃微生物群落具有丰富的多样性,主要包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌,它们各自有其独特的功能,同时又相互联系,共同与宿主之间构成了复杂的微生态系统。为了探明瘤胃微生态系统,一方面要完善传统的微生物分离技术,另一方面要大力发展分子生物学技术,将二者结合起来进行研究。     

分子生物学技术在瘤胃细菌多样性研究中的应用

反刍动物的瘤胃是一个复杂的厌氧微生态发酵系统,研究其瘤胃微生物区系组成与功能已成为反刍动物营养学的重要内容,分子生物学技术是开展瘤胃微生物研究的重要技术手段。本文就变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术、16S r DNA序列分析、宏基因组技术、DNA芯片技术等在瘤胃细菌多样性研究中的应用情况进行了总结与归纳,为今后开展此方面研究工作提供技术参考。     

能量溢出与储备碳水化合物合成对瘤胃微生物生长效率影响的研究进展

瘤胃微生物将一些ATP用来维持代谢,剩余的ATP用来进行储备碳水化合物合成和能量溢出（进行无效循环并产热）,因此,瘤胃微生物蛋白质合成效率较低。瘤胃原虫贮存的碳水化合物占绝大部分。在一些细菌纯培养实验中发现有能量溢出,最近研究发现在混合瘤胃菌群中也能发生能量溢出。通过精确测定碳水化合物贮存和能量溢出的量,以及二者对微生物生长效率的影响,可以预测微生物蛋白质产量,制定提高瘤胃微生物蛋白质生产效率的措施。综述了瘤胃微生物能量溢出和糖原储备规律方面的研究进展,以期为估测微生物蛋白质合成量,提高饲料蛋白质利用效率提供参考。     

瘤胃微生态系统

瘤胃不同的微生物群体和宿主之间的共生关系形成了复杂的生态系统，有助于纤维性饲料转化为挥发性脂肪酸（VFA）,为反刍动物提供能量来源。作者主要强调了利用分子生物学技术鉴定和描述瘤胃微生物的必要性。     

反刍动物瘤胃氮代谢及其与瘤胃微生物相关性的研究进展

通过饲料养分调控瘤胃氮代谢是提高反刍动物氮利用效率的一种有效方式,其中能量和蛋白质对瘤胃氮代谢的影响尤为显著。能量和蛋白质通过调控瘤胃中的微生物进而影响瘤胃氮代谢过程,但两者对瘤胃中不同微生物的影响程度存在差异。本文综述了瘤胃中的氮降解过程、尿素氮循环、能氮平衡对瘤胃氮代谢的调控以及能量和蛋白质与瘤胃微生物之间的关系,为提高反刍动物氮利用效率和减少反刍动物氮排放量的研究提供科学依据。     

尿液嘌呤衍生物法估测瘤胃微生物蛋白质产量及其评价

近年来,以尿液嘌呤衍生物为标记物估测流入十二指肠瘤胃微生物蛋白质产量的非损害(non-inva-sive)方法得到较快发展。该方法的依据是反刍动物尿液中嘌呤衍生物主要来源于瘤胃内微生物体嘌呤的降解,尿液嘌呤衍生物与瘤胃微生物产量成正比。该方法的主要优点是不需要瘘管动物,但对瘤胃微生物蛋白质产量的估测值较十二指肠嘌呤法和15N法估测值低。许多研究者提出了不同的估算公式,适用于牛或羊的估算公式是不同的。     

尿液嘌呤法估测瘤胃微生物蛋白研究

瘤胃微生物蛋白质（MCP）是反刍家畜的重要蛋白质来源。近年来以尿液嘌呤衍生物估测反刍动物瘤胃微生物蛋白产量的方法正逐步取代传统的标记法，其优点是不用瘘管，无损害，操作简单；缺点是其值为相对值，尚需进一步标准化。     

瘤胃微生物宏组学分析及研究进展

瘤胃微生物在反刍动物饲粮消化和吸收中起着重要的作用,深入探索瘤胃微生物群落结构、代谢活动和功能作用,对反刍动物健康和促进饲草利用效率具有重要意义。相对传统瘤胃微生物纯培养方法,组学技术能够更加全面对瘤胃微生物种类、代谢途径、功能进行解释,宏组学联用为系统理解瘤胃微生物降解纤维物质分子机理提供新方式,并受到研究人员越来越多的关注。本文总结了宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学与代谢组学在瘤胃微生物研究中的应用,并围绕宏组学技术联合应用进行综述,为反刍动物瘤胃微生物的研究提供理论支持。     

Microbial and chemical composition of liquid‐associated bacteria in goats' rumen and fermenters

This study was undertaken to investigate the relationship between chemical composition and microbial profile of rumen liquid‐associated bacteria (LAB) in vivo (Murciano‐Granadina goats) and in a rumen simulation system (single‐flow continuous‐culture fermenters). To achieve this aim, analyses of purine bases along with some molecular techniques (quantitative PCR to assess abundance and DGGE to identify biodiversity and bacterial profile) were carried out. A control diet (AHC) based on alfalfa hay (AH) and concentrate (C) in a 1:1 ratio and two experimental diets (AHCBI and AHCBII), in which concentrate was partially replaced with multinutrient blocks, were used. Diets AHCBI and AHCBII included multinutrient blocks differing in the relative amount of two‐stage olive cake and the source of protein (sunflower meal vs. fava beans). We aimed to investigate the effect of these blocks on rumen microbiota to evaluate their potential as safe substitutes of cereal‐based concentrates. Similar patterns of response to diet were found for chemical composition, microbial abundances and diversity in LAB isolated from goat's rumen and fermenters. Whereas bacterial density (log₁₀ gene copies/g FM: 11.6 and 9.4 for bacteria and methanogens, respectively, in rumen) and diversity indexes (Shannon index: 3.6) were not affected by diet, DGGE analyses showed that bacterial community profile was affected. The cluster analysis suggested differences in bacterial profile between LAB pellets isolated from the rumen of goat and fermenters. A relationship between chemical composition and bacterial community composition in LAB pellets seems to exist. Changes in the former were reflected in the bacterial community profile. Further research is needed to clarify the relationship between chemical and microbial composition of ruminal bacterial pellets with diets of different quality.     

Quantification of mucosa-adhered microbiota of lambs and calves by the use of culture methods and fluorescent in situ hybridization coupled with flow cytometry techniques

The intestinal mucosa-associated microbiota could play important biological roles due to its close proximity with the animal host, but knowledge on its composition is still limited. The aim of this study was to characterize the microbial communities tightly associated with different parts (rumen, duodenum and colon) of the gastrointestinal tract (GIT) of healthy lambs and calves by using both cultural, and fluorescent in situ hybridization-flow cytometry (FCM-FISH) techniques. Lactic acid bacteria genera were one of the predominant bacteria detected in lambs and calves by both methodologies, possibly constituting an index of their healthy status. The levels of Lactobacillus were significantly higher (p<0.05) in the rumen and duodenum of lambs, and in the rumen of calves. The levels of Bifidobacterium were significantly higher (p<0.05) in the colon of both animal species and the rumen of lambs. Significant differences (p<0.05) were found in counts of other microbial groups (yeast, Enterococcus, Propionibacterium, Bacteroides, Clostridium and Enterobacteriaceae) at diverse GI sections depending on the animal species. In general, microbial counts follow the same trends regardless the applied technique. The most remarkable differences were found in detection levels of Bacteroides and Clostridium, which tended to be significantly higher (p<0.05) when analysed by FCM-FISH. This technique also allowed the detection of quantitatively important bacteria (sulphate-reducing bacteria, Atopobium and Coriobacterium), which are difficult to cultivate in selective medium. Therefore, FCM-FISH has been proven to be a sensitive high throughput approach that provides additional information to that obtained by traditional culture techniques about the complexity of the GI ecosystem of these animal species.