高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病二重RT—PCR检测方法的建立及应用

高致病性猪蓝耳病病毒（HP—PRRSV）（JX-EF112445）核苷酸序列与经典猪蓝耳病病毒（LP-PRRSV）（U87392）核苷酸序列,设计两对特异性引物,建立了HP—PRRSV和LP—PRRSV二重RT-PCR快速检测体系。应用此体系成功对1498份组织／血清进行了准确检测。同时,分别与商品化的HP-PRRSVRT-PCR检测试剂盒和LP—PRRSV检测试剂盒进行比对试验,结果吻合率达100％,该方法特异性好、敏感性高、克服了对两种病原进行分别检测所带来的耗时、耗试剂、增加污染几率等风险,为蓝耳病的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。     

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。     

一株猪高致病性蓝耳病病毒的分离鉴定与遗传变异分析

为研究猪蓝耳病病毒(PRRSV)的遗传进化规律,于2018年从新疆某猪场采集的病猪血液中分离了一株PRRSV,命名为XJ-b。对临床样品采用RT-PCR扩增鉴定,将阳性样品过滤处理之后接种在Marc-145细胞系进行培养,将盲传3代之后出现病变(CPE)的Marc-145样品进行间接免疫荧光鉴定。通过噬斑纯化后,利用RT-PCR对分离株的全基因组进行扩增,使用SeqMan软件对测序结果进行拼接,并根据NCBI上已公布的PRRSV全基因组及Nsp2基因核苷酸序列进行遗传进化与同源性比对分析。结果表明,临床病料RT-PCR检测呈PRRSV核酸阳性,处理后的病料接种至Marc-145细胞72 h之后产生CPE,间接免疫荧光鉴定为PRRSV抗原阳性;序列拼接显示分离株全基因组开放阅读框大小为15119 bp;全基因组和Nsp2基因核苷酸序列分析和同源性比对显示该分离毒株属于中国的高致病性PRRSV亚群。研究结果可为近年来新疆地区PRRSV的毒株差异分析提供参考。     

建立快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株RT-PCR方法的研究

为了快速区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,试验通过建立的RT-PCR方法获得电泳条带大小不同的PCR产物,以此区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株,并用RT-PCR方法检测实验室保存的12份临床阳性样品。结果表明:可以通过RT-PCR方法区分经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株,并且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等猪常见病毒无交叉反应;临床样品检测试验显示,1份为经典毒株、5份为高致病性毒株、5份为天津疫苗株,与测序结果相符。说明试验成功建立了同时区分猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株和天津疫苗株的RT-PCR方法,且特异性强、灵敏度较高、重复性好、操作简单。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

高致病性PRRSV河北地方株的分离鉴定及部分Nsp2基因变异分析

从唐山某猪场患高热病病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为TS02。应用设计的特异性引物扩增TS02株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较。结果表明,TS02株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株JXA1、GD、WUH1、Jiangxi-3的核苷酸序列同源性分别为97.7%、97.7%、96.5%和97.1%。     

同时检测美洲型及欧洲型PRRSV的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Differential Detection of Classical,Highly Pathogenic and Vaccine Strains of North American Genotype PRRSV

To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×10³ copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV.     

PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

PRRSV高致病性毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中已发表的PRRSV的NSP2基因序列,设计一对特异性引物。针对经典型毒株与高致病性毒株,采用RT-PCR方法扩增,可分别扩增出相应的576bp,486bp的目的片段。从而在检测PRRSV的基础上,进一步区分PRRSV的经典型和高致病性毒株。通过对扩增条件的筛选,成功地建立了猪繁殖与呼吸综合征经典型与高致病性毒株的RT-PCR鉴别诊断方法,且为PRRSV分离株的鉴定分型及NSP2功能研究奠定了基础。     

Isolation and Identification of Highly Pathogenic PRRSV from a Pig Farm

[Objective] To identify suspected cases of highly pathogenic PRRSV from a pig farm. [Method] The suspected cases of highly pathogenic PRRSV were conducted pathologic anatomy, the gene of PRRSV N protein was amplified by RT-PCR and its sequences were determined and analyzed. [Result] The nucleotide sequence of N protein of N7/N8 isolate shared the consistency of 97.0% with highly pathogenic strains(JXA1, Hu N4, SX-1 and TJ), and that of isolate N9 shared the consistency of 97.3% with highly pathogenic strains, indicating the infected virus in the pig farm was highly pathogenic PRRSV. [Conclusion] This research provides a reference for the diagnosis of highly pathogenic PRRSV infec-tion in swine production.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、高致病性株与疫苗株TJM-F92RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株（LP-PRRSV CH-1a）、高致病性株（HPPRRSV TJ）及疫苗株（HP-PRRSV TJM-F92）的Nsp2基因核苷酸序列,设计2对特异性引物1st和2nd,建立鉴别LP-PRRSV、HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92的RT-PCR检测方法。用引物1st对LPPRRSV、HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92进行RT-PCR扩增,分别扩增587、497和497 bp的特异性片段;用引物2nd对HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92进行RT-PCR扩增,分别扩增1 004和644 bp的特异性片段,结合两步RT-PCR扩增结果可达到区分3者的目的;对RT-PCR的特异性、敏感性、重复性进行评价。结果表明,建立的RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于LP-PRRSV、HP-PRRSV与HP-PRRSV TJM-F92的鉴别诊断。     

高致病性猪蓝耳病病原核酸的RT-PCR检测

对高致病性猪蓝耳病病毒（PRRSV）Nsp2基因缺失变异特征,设计特异性引物,建立RT—PCR方法,对疑似高致病性猪蓝耳病病例进行病原核酸检测,并对扩增所得片段进行克隆测序,通过序列分析以验证RT—PCR扩增的特异性。结果表明：发病猪为高致病性猪蓝耳病病毒感染,建立的RT-PCR方法能够鉴别诊断经典猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病感染。