弓形虫致密颗粒蛋白GRA12的生物信息学分析

为分析并预测弓形虫致密颗粒蛋白GRA12基因编码蛋白的结构、功能以及其作为疫苗候选抗原的可能性,本研究从Gen Bank数据库获取GRA12基因序列,通过在线蛋白分析专家系统(Expasy)并结合GENERUNR、DNAStar、DNAMAN等生物信息学分析软件对GRA12序列的编码区进行分析、对该基因编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等信息预测。结果表明:该基因全长1 311 bp,编码436个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为47.8 ku,无信号肽,有6个跨膜区,14个丝氨酸磷酸化位点、7个苏氨酸磷酸化位点、3个酪氨酸磷酸化位点、18个O-糖基化位点、3个乙酰化蛋白附着位点、1个酪氨酸硫酸化位点、1个潜在的N-糖基化位点、1个棕榈酰化位点,15个潜在的抗原表位。研究结果分析说明GRA12有潜力成为弓形虫疫苗候选抗原。     

隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达

本研究旨在进行猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列(登录号:NM_214277)相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17～33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。     

洋草麦HdCAD基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆洋草麦肉桂醇脱氢酶基因（HdCAD）,揭示HdCAD基因的序列特性,对HdCAD蛋白进行生物信息学分析。[方法]以洋草麦转录组数据中的HdCAD为参考序列,设计1对特异引物,利用RT-PCR技术克隆HdCAD基因;利用生物信息学软件对HdCAD基因序列进行分析,对HdCAD蛋白的理化性质、蛋白结构、亚细胞定位等进行预测和系统进化树分析。[结果]HdCAD基因编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸。HdCAD蛋白含有17个磷酸化位点,不含有跨膜结构域和信号肽位点,预测定位在细胞质中;二级结构中,以无规卷曲元件占比最高;含有1个典型的CAD1结构域,属于MDR超家族。系统进化树分析结果显示,HdCAD蛋白与二粒小麦、节节麦、西藏裸大麦亲缘关系最近。[结论]该试验成功克隆HdCAD基因、预测了该基因编码蛋白的序列特征和功能,可以为今后研究洋草麦抗非生物胁迫功能提供参考。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

不同物种肌细胞生成素基因序列结构与功能特性的生物信息学分析

为探讨不同物种肌细胞生成素(MyoG)基因的组成结构与功能特性,利用比较基因组学方法,对GenBank中已报道的猪、牛、绵羊、家兔和家鸡myoG基因完整编码区核苷酸及其氨基酸序列的分子结构、理化特性、糖基化位点、信号肽、跨膜区、二级结构、高级结构域以及基于该基因编码氨基酸序列的5个物种之间的进化关系进行了系统的生物信息学分析。结果表明:猪、牛、绵羊、家兔和家鸡myoG基因核苷酸序列组成结构特点及其编码蛋白质的理化特性基本一致,均属于疏水性不稳定蛋白质;猪、牛和绵羊均含有6个潜在的N-糖基化位点,而家兔和家鸡则包括7个不同的N-糖基化位点;均不含信号肽,属于非分泌型蛋白质,不含跨膜结构域;均含有Basic和H-L-H保守结构域;α-螺旋和无规卷曲为myoG多肽链中的主要二级结构元件,三维结构预测均存在2个Helix与1个Loop结构单元;猪与其他4个物种氨基酸序列的同源性分别为96.0%,95.5%,95.5%和72.2%,牛与绵羊myoG基因进化关系最近。本研究为深入探讨myoG基因调控畜禽骨骼肌的生长发育机制提供了理论基础。     

猪PPAR α蛋白的生物信息学分析

笔者为了探究PPAR的结构和生物学功能,利用生物基因组学数据库,对猪PPAR的氨基酸序列进行初步的生物信息学分析。结果表明,猪PPAR基因编码468个氨基酸,平均分子质量为52.17k Da,为不稳定的亲水蛋白;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,包含9个潜在的O-糖基化位点和28个磷酸化位点;二级结构由α螺旋、β转角、延伸链和随机卷曲组成;该蛋白具有Zn-C4和HOLI两个功能结构域;系统进化分析显示,猪与猫、犬的亲缘关系最近。     

草鱼CD40基因编码区分子序列特征分析

为了研究CD40基因在草鱼出血病中的作用,笔者利用生物信息学分析方法对草鱼CD40基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、蛋白质二级结构、N-糖基化位点、信号肽、结构域等高级结构进行了预测。结果表明,草鱼CD40基因编码288个氨基酸残基,是一不稳定的可溶性蛋白;有2个潜在的N-糖基化位点、存在1个典型的跨膜螺旋区;编码蛋白质的二级结构是以无规则卷曲和β-折叠为主的混合型蛋白。     

气肿疽梭菌CctA全长基因的克隆及生物信息学分析

为了解气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)细胞毒素CctA的生物学功能,参照GenBank中ATCC 10092株序列设计特异性引物,试验采用PCR技术扩增获得CctA基因。通过生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的结构和功能进行预测。结果表明:CctA基因编码317个氨基酸;CctA基因编码蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白,无跨膜区域,但存在信号肽,含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。说明CctA基因是气肿疽梭菌的重要毒力因子,为预防黑腿病疫苗的候选抗原,本试验成功克隆CctA基因,并分析了其编码蛋白的特性,为进一步研究气肿疽梭菌CctA基因功能及其重组蛋白提供参考。     

弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因编码蛋白结构与功能的生物信息学分析

为了分析并预测弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1(Tg MAPK1)基因编码蛋白的结构与功能,探讨其作为疫苗候选抗原及潜在药物靶点的可能性,试验从Gen Bank数据库获取Tg MAPK1基因序列,采用在线蛋白分析专家系统(http://ca.expasy.org/),结合DNAMAN、DNAStar等生物信息学软件对该序列的编码区进行分析,预测该基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点、功能域、亚细胞定位、二级结构、亲/疏水性、抗原表位等。结果表明:该基因全长为1 772 bp,编码区为133~1 731 bp,编码532个氨基酸。编码蛋白性质稳定,理论分子质量为58.376 ku。Tg MAPK1蛋白有5个跨膜区,有3个N端糖基化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个环腺苷酸蛋白激酶磷酸化位点、10个N端肉豆蔻酰化位点及1个酰胺化位点;无信号肽,二级结构以无规卷曲为主;Tg MAPK1基因主要存在于弓形虫虫体外膜上,有20个潜在的抗原表位。说明弓形虫Tg MAPK1基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。     

隆林黑猪氨肽酶N基因的生物信息学分析和原核表达

本研究旨在进行猪氨肽酶N（porcine aminopeptidase N,pAPN）基因扩增和生物信息学分析,并在大肠杆菌中进行表达。从三元杂商品猪和广西地方猪隆林黑猪中扩增出pAPN基因,通过ExPASy和Mega 6.0等软件对其进行生物信息学和系统进化分析;将pAPN克隆到原核表达载体pET-32a（+）,构建重组质粒pET-32a-pAPN,使其在大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中表达。经IPTG诱导表达、纯化,产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果显示,隆林黑猪和三元杂商品猪的pAPN基因长2 949 bp,开放性阅读框为2 892 bp,编码963个氨基酸,同源性为100%,与GenBank数据库中公布的标准序列（登录号：NM_214277）相比,隆林黑猪共有5处氨基酸突变,其中Phe82Asn、Leu107Phe、Leu108Ile和Ser330Pro 4处突变位于pAPN酶催化活性区域,Val621Ile突变位于APN病毒结合区域。pAPN为不稳定的亲水性蛋白,跨膜区位于第17~33位氨基酸,有12个N-糖基化位点,33个B细胞抗原表位预测位点,三级结构为同源二聚体。Val621Ile突变可能影响APN结合病毒的能力。试验成功构建重组质粒pET-32a-pAPN,SDS-PAGE鉴定以包涵体形式表达,纯化后的蛋白在123 ku处有明显条带,且具有良好的抗原性,为进一步获得多克隆抗体、研究该基因和TGEV、PEDV、PDCoV的关系奠定基础。     

猪MBL2基因序列特征分析

研究采用生物信息学方法分析了猪MBL2基因,进一步获得猪MBL2基因序列特征及编码蛋白的结构和功能,并且对CDS区里的编码蛋白的理化性质进行了预测。除此之外还对这些编码蛋白是亲水还是疏水、它们的糖基化位点、信号肽、二级结构以及三级结构进行了预测。实验结果表明,猪的MBL2基因的大小是723 bp,编码的氨基酸共有240个,蛋白质的相对分子质量为25 522.83 KDa,理论等电点PI为4.97。MBL2基因的二级结构是无规则的卷曲型,蛋白结构预测结果是一种可溶性蛋白,具有4个外显子;在第20-21位氨基酸之间存在信号肽,表现为亲水性。研究结果为进一步研究猪MBL2基因的功能提供了理论基础。     

副猪嗜血杆菌广东分离株外膜蛋白P5基因的克隆及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从广东省HPS分离株外膜蛋白P5基因中扩增出与预期设计的1116bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,克隆出HPS广东分离株的目的基因,核苷酸长为1116bp,共编码371个氨基酸,与已发表的HPS(SH0165)外膜蛋白基因核苷酸序列同源性100%,氨基酸同源性100%。生物学预测分析结果显示,HPS外膜蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,其β-转角和无规则卷曲区域可能形成抗原表位;其N端含有1个信号肽,最佳切割位点在21～22个氨基酸;有15个抗原决定簇;无跨膜区;同源建模分析,未见相似三维结构。     

猴源葡萄糖调节蛋白78生物信息学分析及其真核表达

试验旨在探究葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78,GRP78）基因的理化性质和结构特点,阐述GRP78在猪流行性腹泻病毒复制中的分子伴侣作用和调控机制。通过RT-PCR方法扩增GRP78基因,并插入到pMD20-T Simple载体进行克隆测序,利用生物信息学方法对其氨基酸序列、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、三级结构等进行预测和分析。将GRP78基因插入pCDNA 3.1中,然后转染Vero-E6细胞。Western blotting检测Vero-E6细胞中GRP78的表达。生物信息学分析结果表明,GRP78基因全长1 965 bp,编码654个氨基酸,蛋白质分子质量为72.33 ku,理论等电点为5.07,分子式为C₃₁₈₉H₅₁₅₃N₈₆₅O₁₀₁₉S₁₃。遗传进化树分析显示,猴源GRP78基因与双峰驼、犬、猫、大猩猩、蝙蝠、狒狒、猪、马的氨基酸序列同源性为99.5%~99.8%;遗传进化分析显示,大猩猩和狒狒亲缘关系最为接近。跨膜区和信号肽预测结果显示,该蛋白存在信号肽但不存在跨膜结构。GRP78蛋白无N-糖基化修饰位点,存在6个O-糖基化位点、28个磷酸化位点,表明GRP78可能有与激酶磷酸化有关的PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,可能参与己糖代谢和单糖代谢。     

猪PFKL基因克隆及生物信息学分析

试验旨在探究猪精液6-磷酸果糖激酶（6-phosphofructokinase,PFKL）基因的理化性质和结构特点,以期阐明糖酵解在精子发生过程中的生理作用及调控机制。通过RT-PCR技术扩增PFKL基因,将获得的基因片段插入到pUC57载体上进行克隆测序,并结合生物信息学方法预测和分析其氨基酸序列、跨膜结构、修饰位点、二级结构、三级结构、抗原位点、功能注释等。结果表明,PFKL基因全长2 349 bp,编码782个氨基酸,蛋白质分子质量为83.819 ku,等电点为6.96,为酸性蛋白质,分子式为C₃₆₇₄H₅₈₉₇N₁₀₅₁O₁₁₀₉S₄₀。猪源PFKL基因与鼠、鸭、羊、牛、猩猩、人的参考序列同源性均高达80.0%以上。该蛋白不存在跨膜结构和信号肽区域,含有2个N-糖基化修饰位点、14个O-糖基化位点、35个磷酸化位点。PFKL蛋白三维建模结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成,与肌肉型磷酸果糖激酶和血小板型磷酸果糖激酶的同源性分别为68.24%和70.84%。PFKL基因含有的27个抗原位点强弱不同,柔韧性分布较均匀,有较高的表面可塑性,且存在PKC、PKA特异性蛋白激酶的结合位点,为具有较多潜在B细胞抗原表位的亲水性蛋白。GO功能注释分析结果表明,PFKL基因具有碳水化合物激酶活性、磷酸果糖激酶活性,能够参与己糖代谢和单糖代谢。本研究结果为改善精子品质和提高精卵结合发生率奠定了分子生物学基础。     

猪嗜淋巴细胞疱疹病毒2型GD27株gB基因生物信息学分析

试验采用PCR方法扩增出猪嗜淋巴细胞疱疹病毒2型（porcine lymphotropic herpesviruses 2,PLHV-2）gB基因全序列,并进行测序,使用生物信息学软件对gB蛋白进行生物信息学分析和预测。结果显示,gB蛋白由876个氨基酸组成,分子式为C₄₅₀₀H₆₉₇₅N₁₁₉₉O₁₃₅₁S₄₀,分子质量为100.77 ku,等电点为6.45,不稳定系数为38.58;二级结构预测以无规则卷曲为主要结构,1-39位氨基酸为信号肽,761-780位氨基酸为跨膜区结构,具有多种功能位点,存在多处天然非规则结构蛋白;三级结构显示有一个具有溶解作用的环状构象。综合多种方法分析预测结果表明,gB基因存在多个B细胞线性抗原表位,可作为PLHV-2疫苗的候选抗原。     

Bioinformatics Analysis of gB Gene of Porcine Lymphotropic Herpesviruses Strain GD27

The glycoproteins B (gB) gene of porcine lymphotropic herpesviruses 2 (PLHV-2)was amplified by PCR and sequenced, then bioinformatics analysis were conducted. The gB protein was composed of 876 amino acids, the molecular formula was C₄₅₀₀H₆₉₇₅N₁₁₉₉O₁₃₅₁S₄₀, the molecular mass was 100.77 ku, the value of theoretical isoelectric point was 6.45, and the instability index was 38.58. The prediction of secondary structure revealed that some alpha helixes and beta sheets exist in protein while random coil was major pattern. It had a signal peptide in the position 1-39 amino acids and a transmembrane helice in the position 761-780 amino acids. It contained several prosites and several intrinsically disordered proteins. Tertiary structure model of gB protein showed a fusion loop. Multiple antigenic epitope located in gB through comprehensive analysis prediction method. It was suggested that gB gene could be as a candidate antigen for vaccination of PLHV-2.     

拟南芥高亲和性K+载体蛋白基因cDNA克隆及其序列特征分析

以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料,用RNA提取试剂盒抽提总RNA,通过RT-PCR技术和DNA序列测定分析,证实获得了拟南芥高亲和性K⁺载体蛋白基因(AtHKT1)的cDNA序列。该cDNA全长1521 bp,包括506个氨基酸和1个终止密码子序列,且与原序列(accession number AF237672)同源性为99.34%,但与其他科植物HKT1基因同源性较低,注册该基因到GenBank中,注册号为AY685182。利用生物信息学相关软件分析预测AtHKT1基因蛋白质功能和结构,结果发现,该蛋白分子量为57.45 kD,理论等电点为9.33;氨基酸序列中第1～40个氨基酸属信号肽序列;第152～500个氨基酸属Trk H阳离子转运体蛋白保守结构域,并存在蛋白激酶C,酪氨酸蛋白激酶,依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化,糖基化和豆蔻酰化等功能位点;该基因编码的蛋白有10个跨膜结构,N末端、C末端及中部等多个跨膜区具疏水性,符合载体类运输蛋白特点。表明本研究获得了拟南芥AtHKT1基因。     

牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCT_η基因的克隆与生物信息学分析

对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列(AB367928.1)同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。     

Gene Structure Prediction and Molecular Evolution Analysis of Raccoon Dog agouti Gene based on RNA-Seqs

To in-depth analyze the molecular structure characteristics of agouti gene,using bioinformatic methods for RNA-Seqs test to get the complete coding sequence of raccoon dog agouti gene,and its coding protein structure was forecasted and analyzed.The results showed that the length of raccoon dog agouti gene cDNA was 530 bp which contained 396 bp open reading frame (ORF),encoded 131 amino acids.Predicting the weight of the raccoon dog agouti protein molecular was 14.41 ku and isoelectric point (pI) was 9.68,as the unstable hydrophohbic protein;It contained 11 phosphorylation sites,1 glycosylation sites and a long reach 24 amino acid signal peptide;Random coil was the main secondary structure.Phylogenetic tree showed that the raccoon dog had a close genetics distance to vuipe and canis familiaris which was consistent with the traditional animal taxonomy.Through the analysis of the molecular structure characteristics of raccoon dog agouti gene,to provide the oretical basis for revealing the influence of the colour diversity molecular genetics mechanism.