H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10~(-4) ng/μL(1.30×10~4 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。     

禽流感病毒分子生物学检测方法

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病。由于其危害严重，快速、准确的诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。除常规的临床诊断、病毒分离鉴定、血清学检测外，分子生物学检测方法由于具有更加快速、准确的特点愈来愈受到重视，文章就禽流感病毒分子生物学检测方法研究进展做一综述，以期为有效地控制禽流感的流行和暴发提供有力技术支撑。     

H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用

H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大。为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化。以本实验室分离测序确定的30份H5亚型禽流感病毒RNA为模板,将该方法与两种商品化H5亚型禽流感病毒检测试剂盒进行比对,发现该方法与两种商品化试剂盒的检出率分别为100%、98%、98%。敏感性试验显示,该方法可以检测出0.1 fg的RNA模板,灵敏度比两种商品化试剂盒均提高了10倍。结果表明,该方法具有更高的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感的早期诊断。     

禽流感H9亚型一步法RT-PCR快速检测试剂盒的研制及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感H9检测方法,本研究根据GenBank中收录的禽流感H9病毒高度保守的基因序列,设计1对H9的特异性引物,建立了一步法快速检测禽流感的PCR,对反应条件进行优化后,组装成快速检测试剂盒,并对临床收集的疑似禽流感病料进行检测。结果显示,试验成功建立了禽流感H9病毒一步法RT-PCR检测方法,在此基础上完成了试剂盒的组装,对30份疑似禽流感病料的检出率高达98%以上,检测灵敏度达10^1.5ELD₅₀,稳定性良好, 冷冻保存期达12个月。经证实该试剂盒具有操作简便、经济、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点,值得推广应用。     

禽流感通用型RT—PCR快速检测试剂盒

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感检测方法．根据禽流感病毒高度保守的M1基因序列．设计一套通用型引物．建立了快速检测禽流感的PCR一步法．并对反应条件进行优化．组装成快速检测试剂盒．并对临床收集的15份疑似禽流感病料进行了检测。结果显示．疑似禽流感病料检出率在100％以上。检测灵敏度达10^15 ELD50，稳定性良好，冷冻至少能保存12个月。通过对临床样品的检测，证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点．值得推广应用。     

应用免疫扩散试验检测猪瘟预防效果

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种烈性传染病, 世界动物卫生组织将其列为A类传染病,被我国列为一类传染病.为了建立一种简易、快速、准确的检测方法,笔者采用琼脂凝胶免疫扩散试验方法(AGP)检测320份注苗猪血清,结果256份阳性,免疫密度80%,与中和试验的对比检测中,取得了基本一致的结果.用此法大面积检测抗体,可及时了解基层兽医的防疫质量,促使其适时补针,以提高和巩固防疫质量.     

禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、准确的禽流感病毒N9亚型检测方法,根据GenBank中收录的禽流感病毒N9亚型高度保守的基因序列设计引物,通过优化反应条件建立禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,用该方法检测时,H7N9、H10N9均呈阳性,而非N9亚型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽传染病病毒均呈阴性,能检测到1/32血凝单位的H7N9禽流感病毒。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点,值得推广应用。     

鉴别H5亚型两种分支禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为准确区分H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支的毒株,通过对GenBank和GISAID数据库中发表的以及本实验室保存的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行比对,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H5亚型禽流感病毒不同分支毒株的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化,同时开展了特异性和敏感性试验,以及临床应用检测。结果显示:该方法具有良好的特异性,与其他亚型禽流感病毒及常见禽病病毒无交叉反应;对H5亚型禽流感病毒2.3.2.1分支和2.3.4.4分支毒株的检测灵敏度分别为495.0 copies/μL和22.3 copies/μL;100份临床家禽拭子禽流感病毒检测结果与常规RT-PCR和病毒分离检测结果一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异、敏感、准确、耗时少,同时还可区分不同分支,可应用于H5亚型禽流感病毒的准确、快速检测。     

禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772—2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测。结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4 ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足。     

H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列,通过Blast进行比对,在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物,引物扩增的片段大小分别为569bp和424bp,应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法,对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析,以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明,所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569bp的片段,参试的禽肺病毒毒株扩增出424bp的片段,没有其他条带出现,而对照的参试毒株在569bp和424bp处没有任何条带;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测,H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份,禽肺病毒阳性的样品2份;随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析,经比对分析,2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源,2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154)100%同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点,可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。     

禽流感检测方法研究进展

禽流感不仅对世界养禽业带来巨大的经济损失，而且可以感染人，公共卫生意义重大。由于其病毒亚型众多，抗原性变异极快，毒株的致病性也相差很大，早期快速诊断和血清学检测就成为预防和控制禽流感的前提条件。禽流感病毒的传统诊断方法是分离病毒和检测抗体。近年来，又相继建立了血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、酶联免疫吸附试验等血清学诊断技术及分子诊断技术。文章对禽流感检测方法快速诊断进行了概述。     

血清4型禽腺病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速有效的检测血清4型禽腺病毒,本试验针对高度保守的Hexon基因序列设计引物和探针,建立了TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,结果显示:该方法线性关系良好,R~2=0.998;特异性强,对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)均无扩增;敏感性好,最低可检测病毒含量为50拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;稳定性良好,组内和组间重复试验的变异系数分别为0.75%～1.71%和0.60%～1.74%。本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法,为血清4型禽腺病毒感染临床快速、准确诊断提供了技术支撑。     

H4亚型禽流感病毒套式RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种快速、准确检测H4亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型AIV套式RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该法可特异性检测出H4亚型AIV,对其他常见禽病病原体无交叉;敏感性试验结果显示,该法对H4亚型AIV检测下限为360fg/μL;用该法对106份临床样品进行检测,临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究建立的套式RT-PCR方法为H4亚型AIV的早期诊断及有效防控提供了快速、特异和敏感的检测方法。     

禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。     

H9N2亚型禽流感病毒RT-LAMP方法建立及临床应用

本研究建立一种能在基层鸡场使用的快速诊断H9禽流感试验方法（RT－LAMP）,对于快速确诊H9禽流感感染,及时采取措施,降低H9禽流感给鸡场带来的经济损失起到了积极作用。试验结果具有重要兽医临床指导意义。     

H5亚型禽流感病毒荧光检测试纸条的研制

为了对引起家禽重大经济损失和具有公共卫生意义的H5亚型禽流感病毒(AIV)进行快速超敏检测,本研究研制了针对HA蛋白的4株单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞株,通过MAb的两两配对试验,以荧光量子点作为抗体标记生物材料,基于夹心法原理建立了H5亚型AIV荧光免疫层析检测试纸条。结果显示,该方法能够特异性检测出H5N1、H5N2等H5亚型AIV,而与H1N1、H3N2、H7N9、H9N2、NDV等其他病原无交叉反应;对标准检测抗原H5N1(Re-6)的最低检测量为1 ng/mL,比市售H5亚型AIV胶体金检测试纸条灵敏度高100倍;该方法的变异系数(CV)值在10%以内,与商品化的试剂盒检测结果符合率达99.8%。本文建立的H5亚型AIV荧光检测试纸条快速、敏感,检测结果准确可靠,为H5亚型禽流感的流行病学调查和快速诊断提供了基础。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

东莞市规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征血清学调查

建立检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)酶联免疫吸附试验(ELISA),应用该方法对广东省东莞市 17个规模化猪场的216份猪血清进行检测,检出阳性血清102份,阳性率为47.2％。证实我市存在PRRS,为 该病的大面积进行血清学普查提供一种简易、快速、准确的检测方法。     

RT-LAMP检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)的N基因保守区域设计4条引物,通过优化反应条件,建立了检测IBV的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,建立的RT-LAMP方法对IBV参考株扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病病毒(MDV)、传染性囊病病毒(IBDV)等的扩增产物电泳后均无扩增条带。该方法最低能检出0.19 pg的IBV cDNA模板,敏感性比常规RT-PCR方法高1 000倍。用该方法检测了6份临床疑似IB临床病料,检出率为100%(6/6),与常规RT-PCR的符合率为100%。60 min反应结束后,离心可以看到白色沉淀物,简单直观,适用于基层实验室快速准确诊断。     

间接ELISA和HI方法检测禽流感病毒抗体的相关性试验

分别采用商品化的酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒和血凝抑制(HI)试验方法对153份血清样本进行禽流感病毒(AIV)的H5抗体检测,比较间接ELISA和HI两种方法检测结果的相关性。研究结果表明,间接ELISA和HI两种方法呈较好的相关性,二者间的相关系数为0.765。间接ELISA和HI两种方法检测AIV抗体的阳性符合率为95.8%,阴性符合率为87.2%,总体符合率为96.7%。间接ELISA方法是一种敏感、特异和快速的血清学诊断方法,可以用于临床样本的大规模检测。