禽流感通用型RT—PCR快速检测试剂盒

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的禽流感检测方法．根据禽流感病毒高度保守的M1基因序列．设计一套通用型引物．建立了快速检测禽流感的PCR一步法．并对反应条件进行优化．组装成快速检测试剂盒．并对临床收集的15份疑似禽流感病料进行了检测。结果显示．疑似禽流感病料检出率在100％以上。检测灵敏度达10^15 ELD50，稳定性良好，冷冻至少能保存12个月。通过对临床样品的检测，证实该试剂盒具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、稳定性高等优点．值得推广应用。     

H9亚型禽流感病毒免疫层析快速检测试剂盒的研制及应用

利用胶体金免疫层析技术,在建立H9亚型禽流感病毒免疫层析检测方法的基础上组装成试剂盒.试剂盒由试纸卡,稀释液、样品管、塑料吸管、一次性手套及说明书组成.对试剂盒的特异性、敏感性、保存期和重复性等进行了测定.结果表明,试剂盒在室温可以保存6个月,4℃可以保存12个月;与HA试验相比特异性强、灵敏度高、重复性好,操作简单、方便、快捷,能在10 min内准确检测出样品中是否含有H9亚型禽流感病毒.先后制备了5批试剂盒,对武汉市及周边地区的鸡场共抽检498份样品,经病毒分离鉴定准确率达到100%.     

禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法的建立

为建立一种简便、快速、灵敏、准确的禽流感病毒N9亚型检测方法,根据GenBank中收录的禽流感病毒N9亚型高度保守的基因序列设计引物,通过优化反应条件建立禽流感病毒N9亚型RT-PCR检测方法,并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,用该方法检测时,H7N9、H10N9均呈阳性,而非N9亚型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽传染病病毒均呈阴性,能检测到1/32血凝单位的H7N9禽流感病毒。建立了禽流感病毒N9亚型RTPCR检测方法,具有操作简便、灵敏度高、特异性强的特点,值得推广应用。     

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10~(-4) ng/μL(1.30×10~4 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织等病料中,经PCR扩增出大小为217 bp的伪狂犬病病毒gp50的基因片段,结果证实为猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)感染。随后采用BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒的分离培养,该分离株经细胞传代培养5代后,能够产生典型的细胞病变,经PCR鉴定为伪狂犬病病毒,其病毒感染力达10^8.68 TCID₅₀/0.1mL。最后用10^7.0 TCID₅₀/mL病毒培养物接种家兔,48 h后注射部位出现典型瘙痒、皮肤破损等症状,于72 h后全部死亡。结果表明,该伪狂犬病病毒分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫及诊断研究奠定了基础。     

不同H5亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR试剂盒的比较

H5亚型禽流感病毒严重威胁家禽产业的发展和人类健康,实时荧光定量PCR是快速准确诊断该病毒的有效方法之一。比较和分析了国内4种H5亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR试剂盒的灵敏度、重复性和特异性,结果表明,不同厂家的试剂盒总体检测效果都不错,但是不同厂家的试剂盒在灵敏度等方面存在一定差异。     

应用适配体捕获建立H5N1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测技术

基于表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)和适配体捕获相结合技术，建立1种H5N1亚型禽流感病毒快速检测方法。本实验室筛选得到2条针对H5N1亚型禽流感病毒具有良好的特异性和灵敏度的适配体，与磁珠偶联建立针对H5N1亚型禽流感病毒捕获试剂，通过对捕获体系进行原位还原生成纳米银颗粒增强拉曼信号，建立了原位、快速、无损的H5N1亚型禽流感病毒拉曼光谱快速检测技术。结果表明：H5N1亚型禽流感病毒在1 058 cm^-1处有特异性拉曼峰谱，该方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性。该方法的最低检测限达到原病毒液稀释的10¹⁰倍。利用本方法可在10 min内快速检测出待测样本中是否有H5N1亚型禽流感病毒的存在，能够在大体积、低浓度样品中快速检测出目标病原，满足H5N1亚型禽流感病毒临场快检的需求。     

H3N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种简便、快速检测H3N2亚型禽流感病毒的方法,试验根据Gen Bank中H3、N2亚型禽流感病毒HA和NA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件建立H3N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法。结果表明:该方法既能同时特异性扩增出H3N2亚型禽流感病毒,也可扩增出H3、N2亚型禽流感病毒,而对其他亚型和常见禽病病原体均不扩增;该方法对H3N2亚型禽流感病毒的检测下限为10 pg;用该方法对96份临床样品进行检测,结果与病毒分离鉴定结果一致。说明试验所建立的H3N2亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高的特点。     

一步法多重RT-PCR检测新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和传染性法氏囊病病毒方法的建立和应用

根椐GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒[AIV(H9)]和传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的NDV、AIV(H9)和IBDV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增NDV的466bp、AIV(H9)的685bp和IBDV的244bp的特异性片段,而对其他4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10pg的NDV、10pg的AIV(H9)和1pg的IBDV模板。用53份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速及准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9 and H6 subtype avian influenza virus (AIV).Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6 and H9 AIV HA gene,a duplex RT-PCR simultaneous detection of H9 and H6 subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9 subtype AIV single infection samples or H6 subtype AIV single infection samples,and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT-PCR was 5×10⁴ copies/μL. It suggested that this duplex RT-PCR assay was a specific,sensitive,stable and repeatable method for detection of H9 and H6 subtype of AIV,and could provide technical support for the monitoring of H9 and H6 subtype AIV.     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.     

禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立

根据禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）和血凝素（HA）基因序列，设计1对用来鉴定A型AIV特异性引物（NP—F,NP—R）和2对用来鉴定AIV H5和H9不同亚型特异性引物（H5-F，H5-R；H9-F，H9-R），建立了多重RT—PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带。分别为型（NP：330bp）和亚型（H5A：550bp，或H9A：490bp）。通过对105份样品进行检测。并与病毒分离及琼脂扩散（AGP）血清学方法作平行对比，两者之间符合率达100％；试验灵敏度为10^2ELD50。结果表明，建立的多重RT—PCR为检测H5、H9亚型AIV提供了一种快速、经济、易行的技术。     

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313 bp (HA基因)、451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451 bp (NA基因)和667 bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667 bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10^-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

巢式PCR检测H1亚型禽流感病毒方法的建立

为建立快速、准确检测H1亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的方法,本研究针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区设计合成了2对特异性引物并优化反应条件进行巢式PCR反应。特异性和敏感性试验结果表明,该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV,其敏感性最低能检测到13.2 fg/μL的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。     

禽流感病毒通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR 检测方法研究

将套式PCR与荧光RT-PCR技术相结合,叠加这两种技术在敏感性和特异性方面的优势,建立敏感性高于常规荧光RT-PCR的套式荧光RT-PCR检测方法。从GenBank下载禽流感病毒NP基因和HA基因序列,通过比对选取较为保守的片段,设计AIV通用型及H5亚型套式荧光RT-PCR引物和TaqMan探针;利用体外转录技术制备阳性对照,构建目的片段重组质粒;经反应体系和反应条件的优化,建立套式荧光RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法可特异性地检测禽流感病毒及H5亚型AIV,在30份鱼类养殖水样中检测到19份阳性样品,具有较高的敏感性和良好的特异性;具有高通量、快速的特点,可对大批量样品同时进行检测,试验耗时仅需5 h,是自然环境样品中极微量禽流感病毒检测的好方法。     

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度，通过测定已知鸡胚半数致死量（ELD50）的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚，对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量（ELD50）的测定，结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-7.75/0．2mL，H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-8.5／0．2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释，进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定，结果发现：试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-5倍稀释液，该稀释液含有281ELD50病毒量；检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-8倍稀释液，该稀释液含有15．8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时，试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和（或）泄殖腔拭子所采集的病毒量，能够满足检验检疫的实际需要。     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。