稳定表达流感病毒PR8 HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定

为建立稳定表达流感病毒(IV)HA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeⅠ和NotⅠ两个限制性内切酶位点之间插入PR8株HA基因的开放阅读框,构建重组质粒pMX-PR8HA,将pMX-PR8 HA与3个分别表达VSVG、gag/pol和NF-KB的重组质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。用含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行筛选、纯化得到稳定表达PR8株HA蛋白的细胞系。连续传10代后,进行PCR、RT-PCR、IFA和western blot鉴定,结果表明,获得了能够稳定表达IV PR8株HA蛋白的MDCK细胞系。该细胞系的建立有望为IV表达外源基因提供可靠的培养细胞系。     

恒河猴Tetherin蛋白对马传染性贫血病毒抑制作用的研究

Tetherin是新发现的具有限制多种病毒从细胞膜释放功能的细胞蛋白。本研究采用RT-PCR技术从恒河猴巨噬细胞中扩增Tetherin基因,将其插入真核表达载体pEF4/myc-His B中构建重组质粒pHF-Tetherin。并将其转染293T细胞,通过western blot和激光共聚焦分析Tetherin在293T细胞中的表达及亚细胞定位。将pHF-Tetherin分别与马传染性贫血病毒(EIAV)或猴免疫缺陷病毒(SIV)假病毒粒子感染性质粒共转染293T细胞,分析Tetherin对EIAV及SIV出芽的限制作用。研究结果表明,pHF-Tetherin转染293T细胞48 h后可以检测到Tetherin的表达并定位于细胞膜,而且该蛋白具有抑制EIAV及SIV从转染细胞中出芽的生物学功能。     

稳定表达马属动物SAMHD1蛋白的U937细胞系的建立及其抗病毒活性初步研究

为研究马属动物SAMHD1的抗病毒活性,本研究构建了稳定表达马SAMHD1(eqSAMHD1)、驴SAMHD1(doSAMHD1)的U937细胞系。利用pLPCX慢病毒表达载体构建重组质粒pLPCX-doSAMHD1-HA和pLPCX-eqSAMHD1-HA。将重组质粒和假病毒包装重组质粒(pCgp和pVSV-G)共转染于293T细胞中,制备表达SAMHD1的假病毒,将其感染人急性单核细胞白血病细胞系U937,利用嘌呤霉素筛选,建立了稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1的U937细胞系。经western blot鉴定,该细胞系能够稳定表达doSAMHD1和eqSAMHD1蛋白。将人类免疫缺陷病毒(HIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)的假病毒感染该细胞系,结果显示表达eqSAMHD1和doSAMHD1的细胞系均能够显著抑制HIV假病毒复制,限制倍数分别为17~19倍和14~18倍;两种细胞系也能够抑制EIAV假病毒复制,限制倍数分别为3~4倍和2~3倍。该细胞系的建立为进一步评价和研究马属动物SAMHD1的抗病毒机制奠定了基础。     

稳定表达马TRIM5α蛋白的HEK293细胞系的建立及其抗病毒活性初步研究

为建立稳定表达马TRIM5α(eqTRIM5α)的HEK293细胞系,并检测马TRIM5α(eqTRIM5α)的抗病毒功能,本研究将eqTRIM5α克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,构建重组质粒pLPCX-eqTRIM5α-HA,同时构建恒河猴的pLPCX-Rh TRIM5α-HA作为阳性对照。利用VSV-G包装慢病毒,感染HEK293细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立了稳定表达eqTRIM5α和Rh TRIM5α的HEK293细胞系。经western blot和流式细胞术鉴定,该细胞系传代至20代后,仍然能够检测到eqTRIM5α和RhTRIM5α的稳定表达。将该细胞系应用于抗马传染性贫血病毒(EIAV)活性研究中,结果显示eqTRIM5α同RhTRIM5α一样均能够抑制病毒复制,表明eqTRIM5α是一种对EIAV具有较强限制作用的宿主蛋白。该细胞系的建立为进一步评价和研究eqTRIM5α的抗病毒作用和机制奠定了基础。     

稳定表达流感病毒PR8株NS1蛋白MDCK细胞系的建立

根据流感病毒A/Puerto Rico/8/34株NS1基因的核苷酸序列设计引物,PCR扩增后,将NS1完整开放阅读框分别克隆于pMX载体和PET30a载体,成功构建了pMX-PR8-NS1和PET-PR8-NS1重组质粒。将PET-PR8-NS1重组质粒转化Jm109感受态大肠杆菌,诱导表达获得重组NS1蛋白免疫小鼠制备多抗血清。同时,将逆转录病毒载体系统pMX-PR8-NS1、pCI-NF-KB、PMDSV和MDSV共转染293T细胞,制备逆转录病毒样粒子。将逆转录病毒样粒子感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行抗性筛选。然后经过PCR、RT-PCR、间接免疫荧光鉴定,获得稳定表达PR8病毒NS1蛋白的细胞系,将之命名为MDCK-PR8-NS1细胞系。该细胞系的建立有望为深入开展流感病毒NS蛋白生物学功能的研究以及为扩增NS1基因删除的流感病毒提供了有利的工具。     

整合H1亚型流感病毒血凝素蛋白伪型病毒的构建

为构建包装含有H1亚型流感病毒HA蛋白的伪型病毒,本研究将人工合成的H1N1流感病毒(A/Califorma/04/2009株)血凝素(Hemagglutinin,HA)基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装含有HA蛋白的伪型病毒.通过对伪病毒感染细胞中LacZ报告基因表达产物的检测,证明伪病毒可以感染MDCK细胞;同时其感染过程可被流感病毒免疫后的小鼠阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程.本研究所构建的伪病毒系统为研究H1亚型流感病毒HA蛋白抗原特性及新型中和抗体检测方法的建立提供了理想的工具.     

稳定表达山羊SLAM受体的BHK-21细胞系的建立及应用

信号淋巴激活分子(SLAM)又称为CD150,是小反刍兽疫病毒(PPRV)和犬瘟热病毒(CDV)等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥重要作用。为建立稳定表达山羊SLAM(g SLAM)的真核细胞系,本研究将人工合成的g SLAM基因克隆至真核表达质粒p IRESpuro3中,并在该基因的3'端引入Flag标签序列作为分子标记,构建了重组质粒p IRES3-g SLAM。将该重组质粒转染BHK-21细胞,经嘌呤霉素加压筛选及采用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组PPRV病毒(r PPRV/GFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达g SLAM基因的细胞系。r PPRV/GFP感染和western blot鉴定表明,无论是否有嘌呤霉素压力的存在,该细胞系在传代至第20代,仍能稳定表达g SLAM蛋白。由于g SLAM氨基酸序列与犬的同源性较高,以表达GFP重组CDV强毒株(r CDV/GFP)感染该细胞系,病毒可以感染且能形成明显的细胞病变,表明该细胞系可用于CDV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。     

马Viperin的抗EIAV功能初步研究及其重组腺病毒的构建

Viperin是一种细胞内抗病毒蛋白,可以被I型干扰素、多聚I:C、脂多糖及多种病毒诱导表达,在细胞内主要定位在内质网和脂滴,具有广谱的抗病毒功能。为研究马Viperin(eViperin)在抗病毒感染中的作用,本研究应用RT-PCR从马巨噬细胞中扩增eViperin基因,并将其克隆于真核表达载体pDC315中构建重组质粒pDC-eViperin-Flag,将重组质粒转染293T细胞,western blot检测结果表明eViperin在293T细胞中正确表达。将该重组表达质粒与表达马传染性贫血病毒(EIAV)Gag前体蛋白(Gag precursor,Pr55gag)的表达质粒共转染293T细胞,转染48 h后western blot检测,结果显示实验组细胞培养上清中的Pr55gag含量显著低于空白对照组,表明eViperin具有抑制EIAV释放的作用。此外,将该重组表达质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,E3Cre共转染HEK293细胞,进一步构建拯救出表达eViperin的重组腺病毒,为研究eViperin的抗病毒功能研究奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK细胞系

由干扰素诱导细胞产生的GTP蛋白酶M(IRGMs)在抵御病原微生物中发挥着核心作用。为建立IRGMs基因缺失的MDCK细胞系,本研究利用CRISPR/Cas9技术根据MDCK中IRGM4、IRGM5和IRGM6的基因序列设计并合成正链和负链引导RNA(gRNA)的靶DNA序列,以本实验室构建的含有单链引导RNA(sgRNA)骨架转录序列的通用质粒(p Gen-sgRNA)为模板,将U6启动子与合成的相关基因gRNA靶序列经PCR融合扩增,其产物再与sgRNA的骨架转录序列进行重叠延伸PCR扩增,并将扩增产物克隆于p GEM-T载体中,分别构建了具有靶向不同目的基因ORF的gRNA重组质粒。将这些重组质粒分别与pMJ920质粒共转染于MDCK细胞中,通过G418筛选和流式细胞仪分选,并以终点稀释法纯化培养筛选出的单细胞克隆株。经gRNA靶序列片段的测序鉴定,获得了目的基因敲除的MDCK细胞系,并分别命名为MDCK-IRGM4-、MDCK-IRGM5-和MDCKIRGM6-。通过western blot检测经γ干扰素诱导条件下的这3种IRGMs基因在敲除细胞系中相应的蛋白表达均为阴性。这3种MDCK细胞IRGMs敲除的细胞系的建立,为进一步研究IRGMs基因在抗细胞内病原微生物感染中的功能奠定了基础。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

稳定表达兔岩藻糖基转移酶RK13细胞系的建立

为了构建稳定表达兔岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase,FUT2)的RK13细胞系,本研究将FUT2基因编码序列插入到慢病毒载体p LOV-GFP-3Flag中,构建了p LOV-3Flag-FUT2重组质粒。将p LOV-3Flag-FUT2与包装质粒ps PAX2和外膜质粒p MD2.G共转染293T细胞,获得重组病毒样颗粒。用含病毒样颗粒的细胞培养上清液感染RK13细胞,并通过嘌呤霉素筛选、纯化,获得稳定表达FUT2的细胞系,命名为RK-FUT2细胞。连续培养10代后,利用PCR、RT-PCR和Western blot方法鉴定,结果表明,RK-FUT2细胞系能够稳定表达兔岩藻糖基转移酶。该细胞系为研究FUT2在兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)感染过程和致病机制中的作用提供了有力工具。     

H9N2流感病毒诱导MDCK细胞自噬对病毒复制的影响

本试验旨在研究H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬对病毒复制的影响。试验首先建立了稳定表达GFP-LC3的 MDCK细胞系,该细胞系经H9N2流感病毒感染后,激光共聚焦观察到了绿色荧光的点状聚集,得出H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发细胞自噬。随后试验利用3-MA抑制细胞自噬、Rapamycin诱导细胞自噬,荧光定量PCR检测NP mRNA水平,TCID50检测病毒的滴度进行细胞自噬与病毒复制的研究。结果表明： Rapamycin可显著增加NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01）|3-MA可以显著降低NP mRNA水平和病毒滴度（P ＜ 0.01)。说明H9N2流感病毒感染MDCK细胞引发的细胞自噬可促进流感病毒的复制。 [关键词] H9N2 流感病毒|细胞自噬|病毒复制|MDCK细胞|诱导     

稳定表达山羊SLAM受体的Vero细胞系的建立

信号淋巴激活分子（signalling lymphocyte activation molecule, SLAM）又称CD150,是小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）和犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV）等麻疹病毒属病毒感染淋巴细胞的主要受体,在病毒侵入细胞中发挥着重要作用。为了建立稳定表达山羊SLAM真核细胞系,本研究将全基因合成的gSLAM基因克隆至真核表达质粒pIRES2-GFP中,构建了重组质粒pIRES2-gSLAM。将该重组质粒转染非洲绿猴肾细胞（Vero）,经G418筛选后,筛选到稳定表达gSLAM基因的细胞系Vero-gSLAM,该细胞系在传代至第10代,仍能稳定表达gSLAM基因,PPRV N75/1病毒株可以感染且能形成明显的细胞病变（CPE）,相比在Vero细胞上10^-4.65 TCID₅₀/0.1 mL的毒价,在Vero-gSLAM上为10^-5.75 TCID₅₀/0.1 mL,其毒价有所提高。该细胞系可用于PPRV强毒分离和致弱机制等相关研究。     

稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定

SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

重配H9N1亚型流感病毒感染性克隆的构建及鉴定

为了研究禽流感病毒的反向遗传,试验采用霍夫曼发明的8质粒拯救系统,将分离得到的AIV Isolate3(H9N2)基因组,通过RT-PCR得到HA基因,并克隆到以pcDNA3质粒为骨架自行构建的双向转录/表达载体pHW2008上,得到HA转录/表达质粒,再将HA表达质粒与构建好的包含A/Puerto Rico/8/34(H1N1)7个内部基因双向转录/表达质粒共转染人肾上皮细胞(293T)与犬肾细胞(MDCK)混养细胞。结果表明:试验成功构建了重配H9N1亚型流感病毒减毒株。     

牛干扰素诱导跨膜蛋白3对口蹄疫病毒感染的抑制作用

为了研究牛干扰素诱导跨膜蛋白3(bIFITM3)对O型口蹄疫病毒(FMDV)的抑制作用,本试验将表达bIFITM3的重组质粒pLV-bIFITM3和表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的对照质粒pLV-EGFP分别转染BHK-21细胞,通过嘌呤霉素抗性筛选获得能够稳定表达外源基因的细胞系。用O型FMDV感染稳定细胞系,通过观察细胞病变、噬斑分析和实时荧光定量PCR方法评价bIFITM3对O型FMDV感染的抑制作用。结果表明,成功筛选获得稳定表达bIFITM3与EGFP的BHK-21细胞系,bIFITM3表达后显著抑制FMDV感染BHK-21细胞,且抑制作用在病毒感染循环的早期阶段就已显现。本试验证明bIFITM3在FMDV感染中具有抗病毒作用,为口蹄疫的防控研究提供新的思路和理论依据。     

稳定表达施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的BHK-21细胞系的建立

为建立稳定表达施马伦贝格病毒(SBV)核衣壳(N)蛋白的BHK-21细胞系,本研究在SBV-N蛋白编码基因的C端加入6个组氨酸(6×His)标签,将其克隆至慢病毒载体p LV-EGFP-C中构建重组慢病毒质粒p LV-EGFP-SBV-N,将其与慢病毒包装质粒p Helper1.0和p Helper2.0共转染HEK-293T细胞,包装表达SBV-N蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染BHK-21细胞,采用嘌呤霉素(Puromycin)法和细胞有限稀释法筛选出一株稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系,命名为BHK-21-EGFP-SBV-N。间接免疫荧光试验进一步表明,该细胞系能够被SBV抗体阳性动物血清和特异性单克隆抗体2C8识别。稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系的建立,为SBV血清学检测方法的建立提供材料。     

1株猪源2009/H1N1流感病毒反向遗传系统的建立

为建立1株猪源2009/H1N1流感病毒A/swine/Heilongjiang/44/2009(HLJ44)的反向遗传系统,利用双向表达质粒p HW2000,分别构建了该病毒株8个基因节段的重组质粒,将其共转染于293T和MDCK混合培养的细胞,拯救出重组病毒R-HLJ44。测序结果表明,R-HLJ44与亲本病毒HLJ44的核苷酸序列完全一致;二者在细胞上具有相似的增殖特性;抗原性未发生变化;分别以106TCID50的剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,结果显示R-HLJ44与亲本HLJ44在小鼠脏器中的复制滴度也基本一致。以上结果表明拯救的重组病毒保持了与亲本病毒一致的生物学特性。该病毒反向遗传系统的建立,为进一步研究H1N1亚型流感病毒的致病分子机制及新型疫苗研制等奠定了基础。