稳定表达流感病毒PR8 HA蛋白MDCK细胞系的建立及鉴定

为建立稳定表达流感病毒(IV)HA蛋白的MDCK细胞系,本研究利用含有嘌呤霉素抗性基因的pMX载体,在启动子下游的AgeⅠ和NotⅠ两个限制性内切酶位点之间插入PR8株HA基因的开放阅读框,构建重组质粒pMX-PR8HA,将pMX-PR8 HA与3个分别表达VSVG、gag/pol和NF-KB的重组质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。用含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDCK细胞,利用嘌呤霉素进行筛选、纯化得到稳定表达PR8株HA蛋白的细胞系。连续传10代后,进行PCR、RT-PCR、IFA和western blot鉴定,结果表明,获得了能够稳定表达IV PR8株HA蛋白的MDCK细胞系。该细胞系的建立有望为IV表达外源基因提供可靠的培养细胞系。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体的构建及其在293细胞瞬时表达

在293细胞中瞬时表达A/Chicken/Henan/1001/2010（H9N2）NS1基因蛋白,并对表达蛋白活性进行测定。试验利用PCR技术从NS1-T载体质粒上扩增NS1基因,将其克隆至pCAGGS载体,构建重组质粒NS1-pCAGGS;经酶切和测序鉴定正确后,重组质粒NS1-pCAGGS与脂质体按照一定比例混合后转染293细胞,用间接免疫荧光方法对瞬时表达细胞进行荧光信号反应。结果显示,禽流感NS1基因可以很好地在293细胞中瞬时表达,具有良好的反应原性。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒(JEV)NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1(+)免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1(+)空载体免疫组差异极显著(P0.01);pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

禽流感病毒NS1蛋白亚细胞定位研究

为深入研究NS1蛋白的生物学功能,了解NS1蛋白在哺乳动物细胞中的分布和亚细胞定位情况.采用RT-PCR扩增出禽流感病毒NS1基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,经酶切和测序鉴定后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-NS1经脂质体介导转染293T细胞和Hela细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察NS1在细胞...     

表达PRRSV N蛋白稳定细胞系的构建与鉴定

旨在通过慢病毒表达系统构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) N蛋白的Marc-145细胞系。以PRRSV SH1株感染性克隆质粒为模板，通过PCR扩增N基因，并将其克隆到慢病毒载体中，获得重组慢病毒质粒pSin-Ires-Puro-N,将重组质粒pSin-Ires-Puro-N与辅助质粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共转染293T细胞进行慢病毒包装，获得表达N蛋白的重组慢病毒颗粒并将其感染Marc-145细胞，嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，筛选几代后的细胞采用有限稀释法和终点稀释法获得稳定表达N蛋白的Marc-145细胞系。通过PCR鉴定表明细胞系中存在N蛋白基因，通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot试验验证N蛋白能在细胞系中能稳定表达。本研究成功构建了稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系，为研制PRRSV新型复制缺陷型疫苗奠定基础。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布

为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础.     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒（JEV）NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1（+）上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1（+）免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1（+）空载体免疫组差异极显著（P<0.01）;pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体构建与检测

利用pIRES2-EGF和pMX载体以及前期获得的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)构建逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP.采用磷酸钙法将pMX-2S-IRES-EGFP质粒转染到PlatE细胞并获得重组逆转录病毒.通过小鼠成纤维细胞系NIH3T3检测病毒侵染能力,并采用PCR法检测蜘蛛拖丝蛋白基因在NIH-3T3细胞的整合状况.结果显示,成功构建了逆转录病毒载体pMX-2S-IRES-EGFP;通过感染NIH-3T3细胞测定重组逆转录病毒滴度约为2×105 cfu/mL;PCR鉴定结果显示,目的基因2S-IRES-EGFP已整合入NIH-3T3细胞基因组中.     

甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白（NS1）真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒（A/Anhui/3/2013(H7N9)）的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒NS3蛋白的真核表达及鉴定

为了探讨日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机制及其蛋白与宿主蛋白的相互作用关系,试验以GenBank中收录的JEV HW1株NS3基因序列为模板设计引物,经PCR扩增获得NS3基因序列后,采用ClonExpress克隆技术将NS3基因连接到真核表达载体p EGFP-C3上,将得到的产物pEGFP-C3-NS3送生工生物工程(上海)股份有限公司测序;使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent体外转染幼地鼠肾细胞(BHK21细胞),观察24 h后应用Western-blot和IFA法进行鉴定。结果表明:PCR克隆获得的基因片段大小约为1 370 bp,NS3基因片段与HW1株同源性为100%; BHK21细胞密度在70%～80%时质粒转染效果最佳,质粒质量与转染试剂体积的比例为1∶3; Western-blot鉴定融合蛋白成功表达,分子质量约为79 ku; IFA鉴定融合蛋白成功表达,24 h为转染高峰期,绿色荧光最强,pEGFP-C3-NS3与NS3阳性血清反应显红色荧光。说明在BHK21细胞中成功表达出NS3蛋白。     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

猪流感病毒（A／swine／Jiangsu／2／2006（H3N2）NS1基因表达产物分析

采用RT—PCR方法克隆猪流感病毒H3N2亚型NS1全长基因,构建NS1基因原核表达质粒pET-28a—NS1和真核表达质粒p3XFLAG—CMV—NS1,在大肠杆菌和真核细胞内表达NS1基因,制备抗NS1多克隆抗体。用所制备的抗体分析p3xFLAG—CMV—NS1转染表达NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导后,重组蛋白NS1在大肠杆菌中得到表达。表达蛋白纯化后免疫Wistar大鼠制备抗NS1蛋白多克隆抗体,Western—blot分析表明抗NS1多克隆抗体可以识别大肠杆菌表达的NS1蛋白、转染Veio细胞表达的NS1蛋白和病毒感染细胞内的NS1蛋白。间接免疫荧光发现NS1蛋白主要定位于细胞核。结果显示,本试验成功构建了NS1基因原核和真核表达系统,获得了NS1特异性多克隆抗体,分析了NS1细胞定位,为进一步研究NS1蛋白在病毒复制过程中的生物学功能和猪流感病毒的复制机理奠定基础。     

稳定表达PRRSV N蛋白的Marc-145细胞系的构建

为了构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的Marc-145细胞系,以PRRSV全长感染性克隆为模板,通过PCR方法扩增PRRSV N基因,将N基因克隆到慢病毒载体中,获得重组质粒pLenti-CMV-N,利用三质粒慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒转导至Marc...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明：成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1-Flag蛋白在293T细胞中的表达

通过RT-PCR方法扩增出日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株的NS1基因,利用Hind Ⅲ和Hpa Ⅰ双酶切克隆到带有Flag标签的pcDNA3.1载体上,重组质粒命名为pcDNA3.1-NS1-Flag。脂质体法转染293T细胞后,经间接免疫荧光(IFA)和化学荧光Western blotting检测,证明带有Flag标签的NS1基因在293T细胞中得到高效表达。     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Chicken MHCⅠα and β2m Genes and Its Expression in 293T Cells

To explore the mechanism of MHCⅠ molecule in immune response,chicken MHCⅠα and β₂m genes were cloned by PCR.Then the fragments were inserted into the eukaryotic expression vector with fluorescent protein,and the recombinant plasmids pEGFP-MHCⅠα and pmCherry-MHCⅠβ₂m were constructed.The recombinant plasmids were transfected into 293T cell with lipofectin reagent.The gene products of recombinant plasmids were mainly located to endomembrane system of the cells by fluorescence microscopy,and changed the intracellular localization of the fusion with the fluorescent protein.Moreover,the positive reactions were observed by the method of Western blotting,and the proteins had the molecular weight of 68.3 and 41.3 ku,respectively,in accord with the target proteins.The results showed that the recombinant plasmids were expressed in 293T cells with a good immunological activity,and the proteins had the binding reaction with specific antibodies.     

H1亚型猪流感病毒HA基因密码子优化的DNA疫苗免疫保护效力研究

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量及表达抗原的免疫原性有直接关系。为了提高猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）HA基因DNA疫苗的表达量,增强其免疫效果,本研究通过人工合成的方法将H1亚型猪流感病毒A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因密码子优化为猪体内偏嗜性密码子optiHA,同野生型A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）的HA基因分别与真核表达载体PCAGGS连接构成重组质粒PCAGGS—optiHA和PCAGGS—HA,然后分别转染293T细胞,48h后采用间接免疫荧光的方法检测Ⅲ基因的瞬时表达蛋白情况。将质粒PCAGGS—HA、PCAGGS—optiHA以100μg／只的剂量,采用后腿肌肉多点注射的方式,免疫6-8周龄雌性BALB／c小鼠,同时设立空载体PCAGGS对照。共免疫3次,每次间隔2周,三免2周后对每组以10^3.87 EID50的A／Swine／Guangdong／1／01（H1N1）进行攻毒。采用ELISA、血凝抑制试验、细胞因子检测和肺组织病毒含量测定等实验评价这两种DNA疫苗的免疫效果。结果表明,HA基因密码子优化的DNA疫苗可显著提高体液免疫和细胞免疫的应答水平,攻毒后免疫组PCAGGS—optiHA的保护效力明显高于免疫组PCAGGS—HA。这一结果为进一步研究和设计有效的SIVDNA疫苗奠定了基础。     

H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。