鸡肾型IBV山东分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了山东省2006-2007年分离的10株肾型IBV核蛋白(N)基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析.结果发现,10株肾型IBV分离株核蛋白基因均含有1个长1 230 bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失.与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现10株肾型IBV分离株主要分布于2个群中.第Ⅰ群与弱毒疫苗株H120和参考毒株D41、D1466的亲缘关系较近,第Ⅱ群与参考毒株LX4、GDS14的亲缘关系较近.对核蛋白基因及其局部功能区序列比较发现,山东分离株与H120疫苗株核蛋白相比存在广泛的氨基酸变异,以点突变为主,突变位点无明显规律性.     

中国2005年～2006年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

本研究应用RT—PCR方法扩增到我国2005年-2006年8个省市12株IBV病毒核蛋白基因,并将其进行了克隆、序列测定及分析。以疫苗株H120作为参考毒株,对12株IBV分离株核蛋白基因序列进行分析。结果发现我国分离株的N基因及其局部功能区序列存在广泛的氨基酸替代现象。同时还发现毒株CK／CH／LSD／05I与疫苗株H120同源性最高（93.4％）。与GenBank中的11个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的大部分毒株（9株）分布于第1群中,可见我国主要的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群。通过与S1基因系统发育进化树比较发现,毒株CK／CH／LSD／05I存在基因重组现象。以上结果表明我国2005年-2006年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

IBV安徽分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

利用设计的1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增出4株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)安徽地方分离株膜蛋白M基因全长片段并进行了克隆测序。将各IBV安徽地方分离株与GenBank中注册的一些毒株M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较和系统进化关系分析,发现毒株间核苷酸序列同源性为88.5%~100%,其相应的氨基酸序列同源性为90.3%~100%;不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异,从ATG至第140 bp区段的核苷酸序列变异频率最高;4株分离毒株属于同一个进化群的2个不同进化亚群,与我国常用疫苗毒株H120、M41和W 93不属同一个进化亚群。     

鸡传染性支气管炎病毒中国地方分离株膜蛋白基因的克隆及序列分析

本研究选取有代表意义的9株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）国内分离株．利用所设计的一对特异引物，通过RT—PCR的方法成功地扩增了膜蛋白基因即M基因全长片段．通过克隆、序列测定获得了9个分离毒株M基因的全长核苷酸序列。并将各IBV国内分离株与GenBank中注册的一些毒株的M基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较、系统进化关系分析发现：IBV中国地方分离毒株大部分属于Mass型；不同毒株间存着重组、缺失、插入及点突变等变异，从ATG至第150bp区段的核苷酸序列变异频率最高；IBV中国地方分离株M基因的变异属于高频率的同义突变；国内的IBV分离株分为两个基因群，1群分离毒株与GenBank中Mass型的毒株亲缘关系较近．毒株间核苷酸序列同源性为95．7%～100％，其相应的氨基酸序列同源性为98．2%～100%；Ⅱ群分离毒株与众多参考毒株的亲缘关系都比较远，毒株间彼此核苷酸序列同源性为89．7％～91．9%，氮基酸序列同源性为92．0-96．0%。     

广西鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增了广西1985～2008年的24株传染性支气管炎病毒(IBV)分离株的核(N)蛋白基因,并对此24株IBV的N蛋白基因进行了克隆、序列测定及分析.结果发现24株IBV分离株N蛋白均舍有一个长1 230 bp的开放阅读框,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的缺失和插入,但存在较多点突变现象.与疫苗株H120核蛋白的3个保守碱性氨基酸区序列进行比较分析发现,大多数毒株在183～232位存在较多的氨基酸替代现象,部分毒株在334～363位也存在较多的氨基酸替代现象.与GenBank中的13个IBV参考毒株N蛋白基因序列进行比较分析,发现2004～2008年的21个分离株中有19个分布于第Ⅰ群中;1985～1988年的3个分离株之间N蛋白核苷酸及其推导氨基酸的同源性均达99%以上,均属于第Ⅲ群中,可见广西不同时期的IBV分离株在N基因进化关系上形成了自己独立的进化群.同时研究还发现GX-NN5分离株可能为基因重组病毒.以上结果表明了广西IBV毒株存在基因突变和基因重组现象.     

我国部分地区1996-2008年传染性支气管炎病毒分离株膜蛋白基因的遗传变异与系统进化分析

1996-2008年从我国不同地区分离30株传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Viruses,IBV）野毒株的M基因,采用RT-PCR方法克隆测定所分离的野毒株和澳大利亚T株的M基因序列,利用生物信息学软件与GenBank中公布的部分国内外IBV毒株的M基因序列进行比较分析,研究我国IBV的分子流行学特点和分子遗传变异规律。结果发现所测毒株M基因具有4种不同长度的开放阅读框：669bp、672bp、678bp和681bp,分别编码222、223、225和226个氨基酸的多肽,这些长度的差异是由5′端的核苷酸插入或缺失造成的。30个IBV分离株间的同源性在89．5％～100％之间。以疫苗株H120氨基酸位置为参照,在被比较的73株IBVM蛋白中发现62个位点存在变异,其中以2～5、10～16、44～46、217～222等4个区域氨基酸取代率较高。系统进化分析显示,被比较的73个IBV毒株分为5个进化群,我国的IBV分属于其中的4个群,其中第一群和第四群与我国所使用的疫苗病毒株相距较远。同时发现部分近年的分离株与10多年前分离株具有很近遗传进化关系。从M基因看,在我国出现了多种基因型IBV共存的现象,分离株与疫苗株的遗传差异提示我们需要对疫苗的选用做出重新评估。     

广西2013年-2015年鸡传染性支气管炎病毒S1基因分子流行病学分析

为了解近年来广西地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的分子流行病学特点和遗传变异规律,本研究对广西地区2013年-2015年分离的26株IBV的S1基因进行了克隆、序列测定和分析.结果发现,26株IBV S1基因核苷酸序列长度在1 599 bp～1 632 bp之间,编码533个～544个氨基酸,说明分离毒株核苷酸存在较多的插入和缺失;分离毒株之间核苷酸序列同源性在76.5％～100％之间,其推导氨基酸序列同源性在74.4％～100％之间,分离株与参考株核苷酸及推导氨基酸的同源性分别介于75.9％～97.3％和74.9％～96.3％之间;分离毒株可以分为4个主要分支,南宁地区2013年-2014年分离毒株主要在第2分支,而在2015年分离毒株主要分布在第1.1分支,这是一个新的流行趋势,桂林地区的分离毒株主要分布在1.3、4.2分支,2015年以来的3个分离毒株分别存在于3和4.2分支,没有形成比较明显的优势流行毒株,玉林地区的毒株分布较散,也没有形成明显的优势流行毒株;分离毒株中大部分毒株与疫苗毒株同源性较低,部分毒株向着各自的方向进化,呈现出一定的地域性.     

鸡传染性支气管炎病毒国内分离株核蛋白基因的克隆与序列分析

本研究参考已发表的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因序列，设计了一对核蛋白基因的特异性引物NP5、6，经RT-PCR扩增得到了IBV国内分离株DB株、XJ株、DC株、HD株的1199bp的核蛋白基因片段，并进行了克隆和序列测定。将4个国内分离株核蛋白基因的序列与国外发表的参考毒株的核蛋白基因序列进行了比较和分析，结果显示这4个毒株与澳大利亚群的参考毒株亲缘关系最为密切，核苷酸序列同源性86%-91%。其中DC株发生了较大程度的变异。国内分离株核蛋白基因核苷酸的变异引起了蛋白质二级结构的部分改变。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)M基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的传染性支气管炎病毒(IBV)全基因组序列设计引物,对793/B型IBV分离毒株TA03M基因进行克隆与序列分析.结果表明,793/B型IBV的M基因由669 bp组成,与GenBank已发表的15株IBV的M基因相比较,793/B型IBV的M基因在第4～15位发生了3～12个核苷酸的缺失,对应1～4个氨基酸的缺失,共有30多处点突变.与其他各毒株M基因的核苷酸同源性为84.2%～93.6%,氨基酸同源性为82.1%～96.0%;进化分析显示TA03株与H52和IBN毒株之间的亲缘关系较近.该研究为进一步探讨793/B型IBV M基因(蛋白)在遗传变异和免疫等方面的作用奠定了理论基础.     

Isolation and identification of four infectious bronchitis virus strains in China and analyses of their S1 glycoprotein gene

Between 2003 and 2005, four strains of infectious bronchitis virus (IBV) were isolated from the vaccinated chicken flocks in China. The results from chicken embryo cross-neutralization assays showed that all the four isolates were relative to strain A2 of IBV, which was isolated in 1996 in Beijing and related to strain 4/91. The S1 gene of the spike protein was amplified and sequenced. The nucleotide and amino acid sequence of the S1 gene had a similar degree of identity (88.98-99.28%) among the four Chinese IBV isolates. The identity of the S1 protein gene between the four Chinese IBV isolates and 14 strains of other IBVs varied from 70.06 to 81.59%. Phylogenetic analysis suggested that there are at least four groups of IBVs circulating in China and the disease outbreaks might have been caused by infection of multiple strains of IBV.     

鸡肾型传染性支气管炎病毒QD株S1基因的克隆与序列分析

One nephropathogenic infectious bronchitis virus （IBV） strain was isolated from Qingdao city, named as QD isolate.S1 gene of the strain was amplified, cloned and sequenced. The S1 gene of QD isolate was composed of 1620 nucleotides, and a spike glycoprotein cleavage recognition site was Arg-Arg-Phe-Arg-Arg. The nucleotide acid similarities among the nine IBV vaccine strains and the QD strain were 78.8% to 82.2%. Phylogenetic analysis based on the S1 genes showed that QD strain and the vaccine strains belonged to different clusters, and showed larger evolutionary distances, but showed the smaller evolutionary distances with the field nephropathogenic IBV strains in China. The result showed that nephropathogenic IBV strains were widely popular in China, and the QD strain could be used as the infectious bronchitis vaccine candidate strain.     

Detection and molecular characterization of infectious bronchitis virus isolated from recent outbreaks in broiler flocks in Thailand

Thirteen field isolates of infectious bronchitis virus (IBV) were isolated from broiler flocks in Thailand between January and June 2008. The 878-bp of the S1 gene covering a hypervariable region was amplified and sequenced. Phylogenetic analysis based on that region revealed that these viruses were separated into two groups (I and II). IBV isolates in group I were not related to other IBV strains published in the GenBank database. Group 1 nucleotide sequence identities were less than 85% and amino acid sequence identities less than 84% in common with IBVs published in the GenBank database. This group likely represents the strains indigenous to Thailand. The isolates in group II showed a close relationship with Chinese IBVs. They had nucleotide sequence identities of 97-98% and amino acid sequence identities 96-98% in common with Chinese IBVs (strain A2, SH and QXIBV). This finding indicated that the recent Thai IBVs evolved separately and at least two groups of viruses are circulating in Thailand.     

禽传染性支气管炎病毒嗜肾毒株(X株)核衣壳基因的克隆和序列分析

根据已发表的禽传染性支气管炎病毒 (IBV) Beaudette株核衣壳基因序列 ,设计了 1对特异性引物 ,采用 RT-PCR方法 ,克隆了禽传染性支气管炎病毒嗜肾毒株 (X株 )的核衣壳基因 ,并测定了其序列。 X株 IBV与来自 Gen Bank的其他 10株 IBV相比 ,共存在 136个点突变 ,其中有 15处是连续突变区域 ,这些点突变总体呈散在分布。X株与其他毒株的核衣壳蛋白同源性在 90 .2 %～ 99.0 %之间 ,X株 IBV与同为肾型的 N株同源性最高。     

2006年至2010年山东省鸡传染性支气管炎病毒分子变异的研究

为研究山东省鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的遗传变异规律,本研究2006年～2010年从山东省发病的商品鸡中分离鉴定了17株IBV,并对其S1基因、N基因和M基因分别进行RT-PCR扩增、测序及遗传进化分析.序列分析结果表明:与疫苗株H120相比,17个分离株S1蛋白的变异程度较大,存在广泛的基因突变和氨基酸替代,多数病毒株还存在氨基酸的插入;N蛋白无碱基的缺失和插入,仅存在核苷酸的突变和氨基酸的替代;M蛋白除病毒株CK/CH/SD09/005插入3个碱基外,其它16个分离株仅存在少数的碱基突变和氨基酸替代.S1基因、N基因和M基因的系统进化分析结果表明多数分离株的3个基因在进化上相对平行,与国内分离株LX4同属一个进化分支,同源性较高;分离株SDYT0605的3个基因与疫苗株H120同源性较高,可能是免疫压力下变异的疫苗株;分离株SDTA06111、SDWF0608和CK/CH/SD09/005的S1基因、N基因和M基因分属于不同的进化分支,可能发生了基因重组.本研究结果显示基因突变、插入和不同基因之间的重组是免疫压力下IBV变异的主要方式.     

Characterization of infectious bronchitis virus isolates by slot blot hybridization

We used slot blot hybridization of the hypervariable regions of the S1 subunit of spike peplomer gene to identify and characterize infectious bronchitis virus (IBV) strains. Template DNA was created from six reference strain IBVs of different serotypes and immobilized on a nitrocellulose membrane. We synthesized digoxigenin-labeled probes from reference and unknown field viruses and hybridized them to template DNA. All reference strains could be distinguished and isolates identified by serotype if they were at least 95% identical to a reference strain. This slot blot hybridization procedure was specific and reproducible, and strain typing was consistent with the S1 sequencing of the IBV genome. This study thus provides a simple and rapid method for typing of IBV.     

Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines and attenuated heterologous isolates in China against the CK/CH/LDL/97I strain of infectious bronchitis coronavirus

Avian infectious bronchitis virus (IBV) causes tremendous economic losses to the poultry industry worldwide. Different serotypes of this virus show little cross-protection. The present study investigated the genotypic relationship between CK/CH/LDL/97I-type strains and reference IBVs based on S1 gene comparisons and the protection provided by vaccination with commercial vaccines and attenuated homologous and heterologous strains. Phylogenetic analysis and the comparison of S1 showed that CK/CH/LDL/97I-type virus might be a new serotype compared to vaccine strains and other types of IBV isolates in China. Protection efficacy was evaluated by morbidity, mortality, and virus re-isolation from the challenged chicks. Complete protection by IBV vaccination was provided by the homologous strain but sufficient respiratory protection was not provided by the commercial vaccines. Heterologous strains against CK/CH/LDL/97I challenge and the development of a vaccine against CK/CH/LDL/97I-type IBV will be necessary to control infectious bronchitis disease in poultry. Further development of the attenuated CK/CH/LDL/97I strain may provide a valuable contribution towards this goal.     

Genetic diversity of avian infectious bronchitis coronavirus in recent years in China

Fifty-six isolates of avian infectious bronchitis virus (IBV) were obtained from different field outbreaks in China in 2010, and they were genotyped by comparison with 19 reference strains in the present study. The results showed that LX4-type isolates are still the predominant IBVs circulating in chicken flocks in China, and these isolates could be grouped further into two clusters. Viruses in each cluster had favored amino acid residues at different positions in the S1 subunit of the spike protein. In addition, a recombination event was observed to have occurred between LX4- and tl/CH/LDT3/03I-type strains, which contributed to the emergence of a new strain. The most important finding of the study is the isolation and identification of Taiwan II-type (TW II-type) strains of IBV in mainland China in recent years. The genome of TW II-type IBV strains isolated in mainland China has experienced mutations and deletions, as demonstrated by comparison of the entire genome sequence with those of IBV strains isolated in Taiwan. Pathogenicity testing and sequence analysis of the 3' terminal untranslated region revealed that TW II-type IBV strains isolated in mainland China have a close relationship with the embryo-passaged, attenuated TW2296/95.