牛附红细胞体LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛附红细胞体检测方法,本研究根据GenBank上发表的16S rRNA基因(登录号:AF016546)序列设计合成2对LAMP特异引物,建立了检测牛附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)方法,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。LAMP扩增产物经电泳、显色鉴定。结果显示,LAMP方法扩增牛附红细胞体产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光;敏感性检测最低浓度为25.6 fg/μL;特异性试验结果显示,牛附红细胞体检测管显色后呈阳性,而猪附红细胞体、牛新孢子虫、弓形虫及牛瑟氏泰勒虫等对照组均呈阴性,说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛附红细胞体的检测。     

检测日本血吸虫感染性钉螺环介导等温扩增方法的建立

为建立检测日本血吸虫感染性钉螺的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,利用PrimerExplorer V3软件设计4条扩增血吸虫尾蚴钙结合蛋白基因的LAMP引物,酚氯仿法提取血吸虫感染性钉螺、阴性钉螺及肝吸虫感染豆螺基因组DNA进行LAMP反应,LAMP产物经显色、电泳、酶切及DNA序列分析鉴定.在100个阴性钉螺中分别加入20、10、8、6、4、2、1个阳性钉螺,提取DNA后进行LAMP扩增来检测该法的群体检测效果.结果显示,感染性钉螺检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组呈棕色(阴性);感染性钉螺LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性钉螺及感染肝吸虫豆螺无扩增产物;酶切及序列分析结果显示扩增产物为目的基因;LAMP可检测到100个阴性钉螺中含有阳性钉螺的最低数为2.结果表明,检测日本血吸虫感染性钉螺的LAMP方法特异、简便及具有较好的群体检测效果.     

羊口疮病毒环介导等温扩增高效检测方法的建立

羊口疮(ORF)的快速诊断对于该病的防控至关重要,而环介导等温扩增(LAMP)技术可以满足对羊口疮病毒(ORFV)高效性的现场检测需求。本试验对ORFVVIR基因扩增,通过优化反应条件,对LAMP检测ORFV进行了显色反应、特异性和灵敏性的检测,并进行了后续的临床检测。结果显示,利用优化的LAMP染色法,将呈现绿色的阳性组与橙色的阴性组区分开。对扩增的质粒和阳性对照样品的检测呈现出了阳性条带,而对山羊痘、绵羊痘、牛传染性鼻气管炎和牛副流感3型病毒的检测并无阳性条带。优化的LAMP检测ORFV的灵敏度比传统PCR高出1 000倍。对15份临床样品检测的结果表明,优化的LAMP电泳和染色法对ORFV的检出率均为100%,与传统PCR检测结果相一致。上述结果表明优化的LAMP对ORFV的检测具有特异性、高灵敏性且更加方便等优点,从而更适用于现场的高效检测。     

牛瑟氏泰勒虫双拷贝p33表面蛋白基因在原核细胞中的串联表达

为串联融合表达牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)p33表面蛋白,本研究根据GenBank中登录的T.sergenti p33基因序列(D87198),在去掉信号肽的部分设计两对引物。PCR扩增出两段相同的p33基因(p331、p332),大小均为684bp,并将两个基因片段按顺序依次插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建pGEX-p331-p332(2p33)。将pGEX-2p33重组质粒转化E.coli BL21中进行诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示,该融合蛋白获得了高效表达,分子量约为80ku,表达产物以包涵体的形式存在。Western blot试验表明,融合蛋白可被T.sergenti阳性血清识别,具有较好的反应原性。该蛋白的串联融合表达为T.sergenti新型疫苗的研究奠定了基础。     

环介导等温扩增技术快速检测猪流行性腹泻病毒

为建立一种快速、灵敏的检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究针对PEDV的NP基因设计LAMP引物,对反应体系优化并进行特异性及敏感性等试验.结果表明,该方法在65℃下恒温扩增60 min,经SYBR Green Ⅰ染色后仅肉眼观察即可判定结果.该方法特异性好,与传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒及大肠杆菌等无交叉反应,对重组质粒最低检测限度为16拷贝/μL,灵敏度高于普通PCR.该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作方便,适于临床检测PEDV.     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

研究针对布鲁杆菌保守的OMP25基因设计了4条LAMP的特异性引物,通过优化反应条件,建立了布鲁杆菌的LAMP快速检测方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测布鲁杆菌,其最低检测限为5 copies/μL.扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行判定.LAMP可以快速、直观、准确地检测布鲁杆菌,是一种适合基层现场应用的检测方法.     

犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立及初步应用

环介导等温基因扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的检测方法。为提高犬瘟热病毒(CDV)检测效率、降低检测成本,针对犬瘟热病毒N基因保守区的8个位点设计了6条引物进行RT-LAMP一步法扩增。对反应体系及条件优化,检测特异性、敏感性,扩增产物通过凝胶电泳、显色反应和浑浊度比较进行判定。试验结果表明,该方法特异性强、敏感度高,操作简便、快速、便于观察,适用于门诊和现场检测。     

犬瘟热病毒N基因环介导等温扩增检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中CDVN基因保守序列设计合成了2对LAMP引物,内引物FIP、BIP和外引物F3、B3。以CDVN基因重组质粒(pMD-CDV-N)为模板,经反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及临床样品检测。检测结果显示,该方法于61℃水浴60min即可完成反应,最低检出量为70个拷贝,比RT-PCR灵敏10倍。该检测方法仅对CDV产生阳性扩增,而对狂犬病毒,犬细小病毒,犬腺病毒Ⅱ型扩增结果均为阴性。用建立的LAMP方法检测临床样品,检测结果与RT-PCR检测结果一致。本方法简便,特异,有利于CDV的临床检测。     

牛乳房炎金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立灵敏、快速、可视化的牛乳房炎金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)环介导等温扩增技术(LAMP),根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因核苷酸序列为靶序列,设计并合成一组特异性LAMP引物,分别优化反应条件和反应体系,进行特异性和灵敏度试验,并用优化后的方法对临床分离的金黄色葡萄球菌样品进行检测。结果表明,建立的方法可以在64℃反应60 min,得到清晰的梯状条带;反应产物经10×SYBR GreenⅠ染色后,肉眼直接观察或是紫外线照射之后均可判定结果;敏感性试验表明,与常规PCR相比,该方法检测到的金黄色葡萄球菌最低浓度为1×10~1 CFU/mL,灵敏度提高了100倍;该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、伪结核棒状杆菌均无交叉反应;31份临床分离的金黄色葡萄球菌样本检测的结果表明,该方法与传统的PCR检测结果一致。建立的LAMP检测方法特异性、灵敏度良好,可用于临床牛乳房炎金黄色葡萄球菌感染的检测。     

环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒

以人工合成的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72全长基因为模板,利用在线软件Primer Explorer4设计环介导恒温扩增(LAMP)的内、外引物,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了ASFV的LAMP检测方法,同时进行了敏感性和特异性试验。结果表明,所建立的LAMP检测方法最低检测限可达10拷贝质粒DNA,且具有良好的特异性,LAMP产物的酶切鉴定也验证了反应的特异性。对凝胶电泳后紫外观察、肉眼观察颜色变化、生成沉淀观察以及实时荧光PCR扩增曲线Ct值判定等不同判定方法进行比较表明,以上结果判定方法各有其优缺点,其中荧光PCR的敏感性最高,染色法相对较方便直观,电泳法敏感性稍低。     

牛瑟氏泰勒虫套式PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33基因序列设计2对特异性引物,建立套式PCR检测方法。该方法与弓形虫RH株、猪附红细胞体和犬新孢子虫均无交叉反应,能检测到的最低DNA量为15 fg。在75份临床样本检测中,62份为阳性,阳性率为82.7%。由此可见所建立的套式PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于牛瑟氏泰勒虫急性感染和隐性感染的早期诊断,为该病的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供了新的技术手段。     

牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法的建立

本试验根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫ITS基因序列(AY661522.1),应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.31软件设计合成1对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,建立了牛瑟氏泰勒虫ITS基因PCR诊断方法。该方法扩增片段大小为1020 bp,与参考序列的同源性为98%;建立的PCR方法与猪附红细胞体、犬新孢子虫和弓形虫均无交叉反应,最低DNA检出量为1.5 pg/μL;通过对60份临床样品的检测,并与血涂片方法进行比较,结果显示PCR方法具有特异、敏感等特点,适用于牛瑟氏泰勒虫的检测。     

牛瑟氏泰勒虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测牛瑟氏泰勒虫更为特异、敏感的PCR方法,本试验以牛瑟氏泰勒虫p23和p33基因、HSP70基因及18S rRNA基因为靶基因进行PCR检测,并从其敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,4种靶基因引物对牛瑟氏泰勒虫的检测均有较高的特异性,当牛瑟氏泰勒虫基因组DNA浓度为127 ng/μL时,p23、p33、HSP70及18S rRNA4种基因的最小检测量分别为1×105、1×105、1×104和1×106copies/μL;检测临床样本阳性检出率分别为30.19%(16/53)、39.62%(21/53)、47.17%(25/53)和54.72%(29/53)。表明以18SrRNA基因为靶基因的PCR方法从敏感性和临床检出率上明显优于其他3种基因。     

Specific DNA probe for the detection of Theileria sergenti infection in cattle

A simple procedure was developed for detection of Theileria sergenti infection on the basis of hybridization of parasite DNA with a specific probe. A genomic DNA library of T. sergenti constructed in pUC-18 was screened to detect clones containing the parasite's DNA sequences by colony and Southern hybridizations. Two positive DNA inserts were purified from the recombinant plasmids and used as probes labelled with 32P or non-isotopic reagent, biotin-11-dUTP. 32P-radiolabelled and non-radioactive probes appear to be sensitive enough to detect 15 pg (equivalent to 1,200 parasites) and 125 pg (equivalent to 10,000 parasites) of purified T. sergenti DNA, and in diluted T. sergenti-infected red blood cells, they are able to detect 8,000 parasites and 16,000 parasites, respectively.     

Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a simple method that can amplify DNA with high specificity, sensitivity, and rapidity. In this study, we compared the performance of LAMP and real-time PCR assays for diagnosis of toxoplasmosis. We designed a real-time PCR assay targeting a 529 bp element repeated 200-300 times in the Toxoplasma gondii genome. The detection limits of the LAMP and real-time PCR assays were 10 fg/μL and 1 fg/μL of T. gondii DNA, respectively. Conventional PCR, LAMP, and real-time PCR methods were applied to detect T. gondii DNA in blood samples from 284 pigs and 292 sheep. Positive results were obtained with 0.4%, 3.2%, and 4.2% of the pig samples and 3.8%, 17.1%, and 17.8% of the sheep samples with conventional PCR, LAMP, and real-time PCR analyses, respectively. The real-time PCR assay provided the most sensitive diagnosis of toxoplasmosis, but the LAMP assay has potential as an alternative tool for detection of T. gondii in the field.     

猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。     

结核杆菌多位点环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,本研究根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列,以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测,并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明,建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌,也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,可检测到7拷贝/反应。另外,用3种方法同时检测样品发现,LAMP与细菌培养的符合率为90.91%,LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100%。LAMP检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。     

Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.     

沙门氏菌LAMP检测方法的建立

The assay was aimed to establish a rapid, sensitive and specific method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella. According to the highly conserved STN gene of Salmonella reported in GenBank, we designed a set of primers, and then followed by a series of LAMP optimization of reaction conditions, specificity test, sensitivity test, stability test and enzyme test. The sensitivity of LAMP and conventional PCR were compared.The results showed that the optimal reaction temperature of LAMP was 65 ℃, when only amplification of Salmonella, the minimum detectable concentration was 10¹ CFU/mL, which was more than conventional PCR detection by one order of magnitude. The results showed that LAMP method had the qualities of specificity, high sensitivity, short time-consuming and convenience for the detection of Salmonella, which was expected to develop into an effective method