牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立

为建立快捷、灵敏的牛瑟氏泰勒虫(T.sergenti)检测方法,本研究以感染牛T.sergenti的阳性血液为试验材料,建立了牛T.sergenti P33表面蛋白基因环介导等温扩增(LAMP)检测技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。结果显示,扩增产物经显色、电泳、酶切鉴定后,LAMP方法扩增牛T.sergenti产物检测管显色后呈阳性反应,最低检测量为2.3fg/μL模板DNA,比普通PCR高10倍,牛T.sergenti LAMP产物电泳后呈特征性梯状条带,而弓形虫等对照组均无扩增条带。说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛T.sergenti的检测。     

温氏附红细胞体PCR检测方法的建立

本研究旨在建立1种快速准确检测温氏附红细胞体感染的分子生物学诊断方法。根据温氏附红细胞体的16S rRNA基因参考序列的保守区,利用软件Primer Premier 5.0设计合成了1对特异性引物,对温氏附红细胞体的基因组DNA进行PCR检测。结果表明,扩增出1段985bp的DNA序列,EcoRⅠ酶切鉴定得到2条500bp左右的条带,与预期结果一致,说明该方法扩增出了温氏附红细胞体的特异性条带。通过敏感性、特异性、重复性和临床样品检测试验证明,该方法具有特异、灵敏、快速的优点。结果提示,所建立的方法具有较高的特异性和灵敏性,可用于牛附红细胞体病诊断和流行情况监测。     

猪附红细胞体巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立一种更加准确、敏感的猪附红细胞体检测方法,本试验根据猪附红细胞体特异的DNA序列(AJ504999)设计2对巢式PCR引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该检测方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR对猪附红细胞体基因组DNA能扩增出特异性片段,而对弓形虫、链球菌、牛瑟氏泰勒虫、牛附红细胞体基因组DNA扩增反应结果均为阴性;DNA最低检测量为0.124 fg/μL;通过对55份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR的阳性检出率高23.7%。本试验为猪附红细胞体病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法的建立及应用

为建立一种特异、敏感、准确的猪附红细胞体诊断技术,本试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组(NC-015153.1)中的DnaJ基因序列设计合成了一对特异性引物,建立了猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法,进行了特异性和敏感性试验,并与姬姆萨染色镜检方法进行了临床应用比较.结果,猪附红细胞体DnaJ基因PCR诊断方法扩增片段大小为868 bp(GenBank登录号为;JN247670),与GenBank中(NC_015153.1)同源性为99％,该方法扩增不出犬新孢子虫、牛附红细胞体、犬附红细胞体等基因片段,最低检测猪附红细胞体DNA量为124 fg/μL,通过对53份猪血液样本的检测,并与血液涂片姬姆萨染色镜检比较,说明建立的PCR诊断方法具有特异、敏感、准确等优点,完全适用于猪附红细胞体的诊断.     

猪附红细胞体50S核糖体基因PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上最新发布的猪附红细胞体基因组序列(NC-015155)设计一对引物,并以吉林省延边地区猪附红细胞体基因组DNA为模板,建立猪附红细胞体50 S核糖体基因PCR诊断方法,通过特异性、敏感性及临床应用试验验证,快速准确的检测出猪附红细胞体.试验结果显示,建立的猪附红细胞体PCR诊断方法扩增片段大小为10...     

猪附红细胞体环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立猪附红细胞体的快速实用分子生物学检测方法,试验采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法,用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时对新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫病原体进行检测以验证LAMP技术的特异性。结果表明:利用LAMP技术成功检测到猪附红细胞体基因区,此方法的灵敏度可达到5×105倍稀释的DNA分子水平,并且特异性强,对新孢子虫、弓形虫、瑟氏泰勒虫病原体检测均为阴性。     

羊附红细胞体病PCR检测方法的建立

根据羊附红细胞体的16S rRNA基因参考序列，设计1对特异性引物．建立了检测羊附红细胞体的PCR技术。用本方法从感染血样中特异扩增出1条预期大小为1169bp的片段。该方法灵敏、快速、特异性高．可用于羊附红细胞体病的早期快速诊断和流行病学调查。     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。     

犬附红细胞体PCR检测方法的建立及应用

通过将GenBank上报道的犬附红细胞体16S rRNA基因序列与其他物种同源序列进行比对,取其种间特异性和种内保守性较高区域设计1对引物,以吉林省延边地区犬附红细胞体基因组DNA为模板进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验验证,建立犬附红细胞体PCR诊断方法,应用于临床检测。结果表明:该方法可成功扩增出大小为529 bp的犬附红细胞体片段,与GenBank中German no.1(AY150973.1)序列同源性为98.5%。其最低DNA检测量为25 fg/μL,不与犬巴贝斯虫、犬弓形虫及猪附红细胞体等病原体基因组产生交叉反应。同时通过对57份犬血液样本的检测结果说明,该方法检出率明显高于姬姆萨染色镜检法,且避免了假阳性。本试验所建立的PCR检测方法具有特异、敏感、准确等优点,为犬附红细胞体病的诊断提供了一种可靠的方法。     

牛附红细胞体单管套式PCR检测方法的建立

为快速、准确地检测出牛附红细胞体,根据GenBank上发表的牛温氏附红细胞体(Mycoplasma wenyonii)l6S rRNA基因序列(登录号AF016546)设计合成内外2对引物,建立了牛附红细胞体单管套式PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性及应用试验。结果:建立的牛附红细胞体单管套式PCR检测方法扩增的片段大小为361 bp,与GenBank中相应序列同源性为98%,该方法扩增不出牛瑟氏泰勒虫、新孢子虫、布氏杆菌及牛无乳链球菌等基因片段,检测出标准模板DNA的最小量为1.22 fgμ/L。通过对吉林省延边地区66份血液样本的临床检测显示,单管套式PCR检出率28.8%,高于常规PCR的21.2%和鲜血压片镜检的12.1%,具有准确、特异、敏感等优点,是检测牛附红细胞体的一种新型、可靠的诊断技术。     

奶牛附红细胞体的分类鉴定及诊断方法的建立

为了从分子水平上确定奶牛附红细胞体（E．wenyoni）的分类学地位及建立奶牛附红细胞体感染诊断方法。本研究通过利用原核生物16S rRNA基因通用引物，对分离得到的奶牛附红细胞体（广西株，E．wenyoni-GX）进行16SrRNA基因的克隆及测序。并建立系统发育进化树；同时根据测序结果设计诊断引物，建立奶牛附红细胞体感染的PCR诊断方法。结果扩增出长约1．5kbp的奶牛附红细胞体的16SrRNA基因片段；特异性试验和敏感性试验表明。所建立的PCR方法与常见支原体、细菌及原虫元交叉反应，能检测奶牛附红细胞体最低DNA量为0．145fg。通过试验结果分析，建议将奶牛附红细胞体这类血营养菌划归入支原体科、支原体属；同时，所建立的PCR诊断方法是特异、敏感、快速的，可应用于临床检测。     

副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的副猪嗜血杆菌(Hps)检测方法。针对Hps16S rRNA基因保守区域设计6条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对模板DNA进行梯状等温扩增,并且优化LAMP的反应体系,检验其灵敏性与特异性。结果表明:该方法对Hps的最小检测限为0.2pg/μL,灵敏性高于常规PCR方法103倍;完成反应仅需65min。该方法灵敏度高、特异性好,能够作为Hps的快速诊断方法,对于基层和实验室应用均具有良好前景。     

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型（EHV-1）的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术（LAMP）,同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B（gB）基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1 DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65 ℃恒温下作用50 min,使EHV-1 DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型（EHV-4）等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10^-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。     

布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立及初步应用

根据肝螺杆菌fla B基因保守区域设计一组特异性引物,经过条件优化、特异性和敏感性分析,成功建立了肝螺杆菌LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP扩增方法仅能检测出肝螺杆菌,其他常见细菌未见特异性扩增。检出肝螺杆菌最低模板量为86.9fg/L,是普通PCR所需模板量的1/10。本研究建立的LAMP快速检测方法具备操作简单、特异性好、灵敏度高的优点,结果易于观察,对仪器设备要求低,适宜推广应用。     

Detection of canine parvovirus in fecal samples using loop-mediated isothermal amplification.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel, sensitive, and rapid technique for detection of genomic DNA. The end-product of the technique is a white precipitate of magnesium pyrophosphate that is visible without the use of gel electrophoresis. The LAMP method was applied to the detection of canine parvovirus (CPV) genomic DNA. A set of 4 primers, 2 outer and 2 inner, were designed from CPV genomic DNA targeting the VP2 gene. The optimal reaction time and temperature for LAMP were determined to be 60 minutes and 63 degrees C. On the basis of results for 50 canine fecal samples using polymerase chain reaction (PCR) analysis as the gold standard, the relative sensitivity of LAMP was 100% and the relative specificity was 76.9%. The detection limit of the LAMP method was 10(-1) median tissue culture infective doses (TCID50)/ml, compared with 10 TCID50/ml for PCR analysis. In addition to the advantage resulting from visual detection of the end product, the LAMP method is very rapid, requiring only 1 hour to complete. This assay would be a viable alterative to PCR analysis for diagnosis of CPV infection in dogs. The LAMP method holds promise for use as a diagnostic assay for CPV detection in a clinical setting.     

沙门氏菌LAMP检测方法的建立

The assay was aimed to establish a rapid, sensitive and specific method of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of Salmonella. According to the highly conserved STN gene of Salmonella reported in GenBank, we designed a set of primers, and then followed by a series of LAMP optimization of reaction conditions, specificity test, sensitivity test, stability test and enzyme test. The sensitivity of LAMP and conventional PCR were compared.The results showed that the optimal reaction temperature of LAMP was 65 ℃, when only amplification of Salmonella, the minimum detectable concentration was 10¹ CFU/mL, which was more than conventional PCR detection by one order of magnitude. The results showed that LAMP method had the qualities of specificity, high sensitivity, short time-consuming and convenience for the detection of Salmonella, which was expected to develop into an effective method     

应用环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌的研究

目的建立环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生李斯特菌。方法根据单核细胞增生李斯特菌(LM)hlyA基因序列中的保守区域,采用在线引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,获得一套特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,对单核细胞增生李斯特菌hlyA基因进行LAMP扩增,并与常规PCR方法进行比较。结果建立的LAMP方法能成功扩增出梯形条带,LAMP检测单核细胞增生李斯特菌纯培养物和人工染菌的灵敏度为5.44×102cfu/mL,而对照PCR检测的灵敏度为5.44×104cfu/mL。对10株细菌进行LAMP扩增,仅单核细胞增生李斯特菌得到阳性结果。从DNA提取到报告结果,耗时仅1h。结论 LAMP检测单核细胞增生李斯特菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便,有望发展成为快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌的有效手段。     

肠炎沙门菌LAMP检测方法的建立

为建立一种能快速检测肠炎沙门菌(SE)的方法,本研究根据基因库中SE种特异性基因(sdfⅠ)的保守序列,设计一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了SE的LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达100fg DNA,高于常规PCR方法100倍;全部反应可在1h内完成;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其他常见病原体的检测结果均为阴性。结果表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于SE感染的快速检测。